Одноцепочечные матрицы для синтеза зондов можно легко и быстро получить, используя стандартные методики.
Матрицы, приготовленные по методике из табл. 1, обычно получаются в концентрации около 100 мг/мкл, однако лучше оценить концентрацию данной партии путем сравнения со стандартными растворами в геле, окрашенном бромидом этидия.
Учитывая, что молекула матрицы является одноцепочечной и кольцевой, ее нельзя пометить с помощью рассеянных затравок или методами никтрансляции. В этом случае следует воспользоваться техникой достройки праймера.
По этой методике синтетический олигонуклеотид, комплементарный последовательности, находящейся со стороны З-конца минисателлитной вставки, отжигается на матрице в растворе. В результате чего появляются З'-гидроксильные группы, к которым большой фрагмент ДНК-полимеразы I может присоединить меченые дезоксирибонуклеозиды. По истечении времени, необходимого для синтеза комплементарной цепи по всей длине вставки, можно использовать рестриктазу для расщепления новой двухцепочечной молекулы у б'-конца вставки.
Последовательность является частью фагового гена III, кодирующего белок, который участвует в прикреплении к бактериальным F-лилям в ходе инфекции и содержит два участка GC-богатых тандемных повторов. Эти последовательности отжигаются с конкурентной ДНК, содержащейся в большинстве гибридизационных буферов, поэтому для получения картины геномных «отпечатков пальцев» необходимо исключить этот компонент при использовании указанного зонда.
Семейство ГВР, выявляемое тандемным повтором из гена III бактериофага М13, отличается от семейств детектируемых с помощью минисателлитных зондов 33.6 и 33.15, но сходно с ними высокой степенью полиморфизма, а также тем, что частота аллелей уменьшается пропорционально их размерим. Средняя частота совпадения для одной полосы у индивидов европейского происхождения, не находящихся в родстве, составляет около 0,20 для фрагментов больше 2 т. п.н., причем для отдельного индивида таких полос выявляется 15–20. Таким образом, тандемный повтор М13 выявляет картину «отпечатков ДНК», сравнимую по своей сложности с картинами, получаемыми при использовании минисателлитов, и позволяет проанализировать 15 – 20 дополнительных гипервариабельных участков в ДНК человека и других млекопитающих. Так как повтор М13 не содержит сайтов узнавания для рестриктаз Hinll, Mbol, НаеШ и Alul и поскольку распределение детектируемых фрагментов сходно с таковым для отпечатков, полученных с помощью минисателлитов, представляется удобным и эффективным готовить блоты для гибридизации по очереди с каждой из трех, проб.
Прочие статьи:
Хозяйственное значение
а) Экономическое значение и добывание.
Песец доставляет очень ценную пушную шкурку. Песец - важный промысловый зверь и экономика многих районов зависит от успеха его промысла. По общей ценности добываемых шкурок песец занимает одно из пе ...
Наземно-воздушная среда обитания
В ходе эволюции эта среда была освоена позже, чем водная. Ее особенность заключается в том, что она газообразная, поэтому характеризуется низкими влажностью, плотностью и давлением, высоким содержанием кислорода. В ходе эволюции у живых о ...
Места обитания
Касатка - космополит: живет во всех океанах от Арктики до Антарктики, где далеко заходит в плавучие льды. В тропиках встречается реже, чем в холодных и умеренных водах. Здесь она концентрируется вблизи тюленьих и котиковых лежбищ, близ мо ...