Одноцепочечные матрицы для синтеза зондов можно легко и быстро получить, используя стандартные методики.
Матрицы, приготовленные по методике из табл. 1, обычно получаются в концентрации около 100 мг/мкл, однако лучше оценить концентрацию данной партии путем сравнения со стандартными растворами в геле, окрашенном бромидом этидия.
Учитывая, что молекула матрицы является одноцепочечной и кольцевой, ее нельзя пометить с помощью рассеянных затравок или методами никтрансляции. В этом случае следует воспользоваться техникой достройки праймера.
По этой методике синтетический олигонуклеотид, комплементарный последовательности, находящейся со стороны З-конца минисателлитной вставки, отжигается на матрице в растворе. В результате чего появляются З'-гидроксильные группы, к которым большой фрагмент ДНК-полимеразы I может присоединить меченые дезоксирибонуклеозиды. По истечении времени, необходимого для синтеза комплементарной цепи по всей длине вставки, можно использовать рестриктазу для расщепления новой двухцепочечной молекулы у б'-конца вставки.
Последовательность является частью фагового гена III, кодирующего белок, который участвует в прикреплении к бактериальным F-лилям в ходе инфекции и содержит два участка GC-богатых тандемных повторов. Эти последовательности отжигаются с конкурентной ДНК, содержащейся в большинстве гибридизационных буферов, поэтому для получения картины геномных «отпечатков пальцев» необходимо исключить этот компонент при использовании указанного зонда.
Семейство ГВР, выявляемое тандемным повтором из гена III бактериофага М13, отличается от семейств детектируемых с помощью минисателлитных зондов 33.6 и 33.15, но сходно с ними высокой степенью полиморфизма, а также тем, что частота аллелей уменьшается пропорционально их размерим. Средняя частота совпадения для одной полосы у индивидов европейского происхождения, не находящихся в родстве, составляет около 0,20 для фрагментов больше 2 т. п.н., причем для отдельного индивида таких полос выявляется 15–20. Таким образом, тандемный повтор М13 выявляет картину «отпечатков ДНК», сравнимую по своей сложности с картинами, получаемыми при использовании минисателлитов, и позволяет проанализировать 15 – 20 дополнительных гипервариабельных участков в ДНК человека и других млекопитающих. Так как повтор М13 не содержит сайтов узнавания для рестриктаз Hinll, Mbol, НаеШ и Alul и поскольку распределение детектируемых фрагментов сходно с таковым для отпечатков, полученных с помощью минисателлитов, представляется удобным и эффективным готовить блоты для гибридизации по очереди с каждой из трех, проб.
Прочие статьи:
Историческая экспозиция
Итак, 1786 год, конец XVIII века – века Просвещения, который для науки был тем же, чем XV–XVI века – века Возрождения – были для искусства.
В сущности, естественные науки в подлинном смысле этого слова возникли именно в эту эпоху. Измени ...
Факторы, влияющие на численность
Песец - один из ценных видов пушных зверей. По размерам песцового промысла Россия занимает первое место в мире. В дореволюционное время в России добывали десятки тысяч песцов и около ¾ части добычи распродавали на промышленных ярма ...
Геологические эры и эволюция жизни
Органический мир развивался в течение миллиардов лет вместе с той средой, в которой ему приходилось существовать, т. е. вместе с Землей. Поэтому эволюцию жизни невозможно понять без эволюции Земли, и наоборот. Владимир Ковалевский (1842–1 ...