Одноцепочечные матрицы для синтеза зондов можно легко и быстро получить, используя стандартные методики.
Матрицы, приготовленные по методике из табл. 1, обычно получаются в концентрации около 100 мг/мкл, однако лучше оценить концентрацию данной партии путем сравнения со стандартными растворами в геле, окрашенном бромидом этидия.
Учитывая, что молекула матрицы является одноцепочечной и кольцевой, ее нельзя пометить с помощью рассеянных затравок или методами никтрансляции. В этом случае следует воспользоваться техникой достройки праймера.
По этой методике синтетический олигонуклеотид, комплементарный последовательности, находящейся со стороны З-конца минисателлитной вставки, отжигается на матрице в растворе. В результате чего появляются З'-гидроксильные группы, к которым большой фрагмент ДНК-полимеразы I может присоединить меченые дезоксирибонуклеозиды. По истечении времени, необходимого для синтеза комплементарной цепи по всей длине вставки, можно использовать рестриктазу для расщепления новой двухцепочечной молекулы у б'-конца вставки.
Последовательность является частью фагового гена III, кодирующего белок, который участвует в прикреплении к бактериальным F-лилям в ходе инфекции и содержит два участка GC-богатых тандемных повторов. Эти последовательности отжигаются с конкурентной ДНК, содержащейся в большинстве гибридизационных буферов, поэтому для получения картины геномных «отпечатков пальцев» необходимо исключить этот компонент при использовании указанного зонда.
Семейство ГВР, выявляемое тандемным повтором из гена III бактериофага М13, отличается от семейств детектируемых с помощью минисателлитных зондов 33.6 и 33.15, но сходно с ними высокой степенью полиморфизма, а также тем, что частота аллелей уменьшается пропорционально их размерим. Средняя частота совпадения для одной полосы у индивидов европейского происхождения, не находящихся в родстве, составляет около 0,20 для фрагментов больше 2 т. п.н., причем для отдельного индивида таких полос выявляется 15–20. Таким образом, тандемный повтор М13 выявляет картину «отпечатков ДНК», сравнимую по своей сложности с картинами, получаемыми при использовании минисателлитов, и позволяет проанализировать 15 – 20 дополнительных гипервариабельных участков в ДНК человека и других млекопитающих. Так как повтор М13 не содержит сайтов узнавания для рестриктаз Hinll, Mbol, НаеШ и Alul и поскольку распределение детектируемых фрагментов сходно с таковым для отпечатков, полученных с помощью минисателлитов, представляется удобным и эффективным готовить блоты для гибридизации по очереди с каждой из трех, проб.
Прочие статьи:
Трюфель
Трюфель(нем. Trüffel) — сумчатый гриб с подземными клубневидными мясистыми плодовыми телами. Большинство относится к порядку трюфелевых (Tuberales). Растут в лесах как сапрофиты или образуют микоризу с корнями деревьев. Некоторые пло ...
Глава 1
Из всего окружающего нас несметного множества звезд несопоставимо важнейшую роль в нашей жизни играет Солнце. Эта ближайшая к нам звезда обеспечивает нашу планету подавляющей частью энергии, которой мы располагаем на Земле. Благодаря солн ...
Наука Древней Греции
Задача понять и объяснить мир без привлечения таинственных сил была впервые поставлена древними греками в период развития
рабовладельческого строя [3]. Возникновение греческой науки (VII-VI вв. до н. э.) обычно связывают с расцветом иони ...