ДНК-рестриктазы и ДНК-метилазы
Страница 1

Статьи » Получение рекомбинантного аденовируса CELO » ДНК-рестриктазы и ДНК-метилазы

Это ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции- модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции.

По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз. Ферменты рестрикции типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной, ДНК-метилазной и АТРазной активностями. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия АТР, S-аденозилметионина и ионов Mg , они не распознают специфические последовательности нуклеотидов и в силу этого не находят широкого применения в генной инженерии. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, требуют для проявления активности наличия в реакционной смеси АТР и ионов Mg2" и чаще всего используются при молекулярном клонировании. Ферменты типа III объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Они также активны только в присутствии АТР и ионов Mg2 и не проявляют абсолютной зависимости от S-аденозилметионина. Названия рестриктаз складываются из первой буквы родового и двух букв видового названия бактерий, в которых они обнаружены, например Есо - Е. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы с и d. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например Hael, Haell и НаеШ из Н. aegipticus. Рестриктазы типа II - основной инструмент генной инженерии. Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, а по крайней мере три из них - октануклеотиды. Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой (50% А-Т-пар и 50% G-C-nap). Так, случайная тетрануклеотидная последовательность встречается в среднем через каждые 256 п.о., а гексануклеотидная - через каждые 4096 п.о. Однако в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и соответственно сайтов рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hhal, Hpall, TaqI, Thai, Aval, Haell, Hindll, Sail, Smal, Xhol, Xmal). Существенное отклонение частоты встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их распределении вдоль ДНК свойственно и хромосомам термофильных бактерий, которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G-C-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа II, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoRI - 5'-GAATTC- 3'. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу. Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между собой взаимодействовать, их часто называют "липкими" концами. В "липких" концах выступающим одноцепочечным участком может быть как 5'-, так и З'-конец Формальным признаком образования 5'- или 3'-выступающих "липких" концов в сайтах рестрикции является расположение точки расщепления цепей ДНК в последовательности, используемой для обозначения сайта рестрикции, слева или справа от оси симметрии соответственно. У некоторых рестриктаз точки расщепления обеих цепей ДНК расположены непосредственно друг под другом в сайте рестрикции. В этом случае после расщепления ДНК "липких" концов не образуется, а получаются так называемые "тупые" концы, в которых нет выступающих одноцепочечных участков ДНК. Имеется одно принципиальное функциональное различие между 5'- и 3'-выступающими "липкими" концами - последние невозможно пометить путем их достройки ДНК-полимеразой. Эту особенность следует иметь в виду при выборе рестриктаз для получения рестрикционных фрагментов ДНК, которые предполагается использовать в качестве зондов.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Регуляция висцеральных функций
Эта функция осуществляется преимущественно через деятельность гипоталамуса, который является диэнцефалическим звеном лимбической системы. О тесных эфферентных связях системы с внутренними органами свидетельствуют разнообразные изменения и ...

Вирусы животных, растений и бактерий
Поскольку вирусы обнаружены в клетках организмов разных систематических групп, мы рассмотрим здесь вирусы человека, животных (млекопитающих), растений и бактерий раздельно. Вирусы человека и животных являются наиболее изученными по сравн ...

Концепция эволюции в биологии. Чарльз Дарвин - основоположник теории эволюции.
Учение Дарвина - "Происхождения видов путем естественного отбора". Причины эволюции - борьба за существование и естественный отбор. Инструмент эволюции - изменчивость. При этом на первое место по значению для эволюции видов Дарви ...

Разделы