Векторы

Ферменты, описанные в предыдущем разделе, позволяют производить тонкие манипуляции как с протяженными молекулами ДНК, так и с их фрагментами. В частности, с помощью рестриктаз можно с большой точностью разрезать молекулы ДНК, а образовавшиеся в результате фрагменты соединять в любой желаемой последовательности друг с другом, восстанавливая сахаро- фосфатный остов молекулы ДНК с помощью ДНК-лигазы. Однако с использованием только этих ферментов еще нельзя решить одну из основных методических задач молекулярной генетики - выделение любой требуемой нуклеотидной последовательности в чистом виде и в количестве, достаточном для исследования этих последовательностей биохимическими методами. Исключение составляет метод ПЦР, однако его применение ограничивается короткими последовательностями нуклеотидов.

Основная идея, позволяющая решать эту задачу, заключается в том, чтобы присоединить исследуемые фрагменты ДНК к молекуле-переносчику, которая могла бы автономно существовать внутри бактериальных или эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Такие молекулы- переносчики фрагментов нуклеиновых кислот были созданы, их называют векторами, и они являются одним из важнейших инструментов генной инженерии.

Идеальная векторная молекула должна обладать несколькими обязательными свойствами. Во-первых, любой вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. Во-вторых, в любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. В-третьих, структура векторной молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности. Для конструирования векторов в генной инженерии используют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные к автономной репликации в бактериальных и эукариотических клетках - плазмиды, хромосомы вирусов, а также фрагменты хромосом эукариотических клеток /15, 16/.

Различные векторы для клонирования ДНК и их рестрикционные карты приведены на рисунке 1.4

Первые эффективные векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, не утратившие своего значения и поныне, были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR, создана на основе репликона природной плазмиды ColEI, придающей клеткам Е. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Таким образом, бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками. Генетическая карта одного широко распространенного вектора этой серии - pBR322 изображена на рис. II.5,а.

Такая плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 и.о. Последовательность нуклеотидов pBR322 полностью известна. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Тс) и ампициллину (Ар), которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSClOl и транспозона ТпЗ соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и(или) ампициллина. Плазмида pBR322 содержит также обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках Е. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). Характерной чертой плазмиды pBR322, как и любого современного вектора, является наличие в ней нескольких уникальных сайтов рестрикции, обозначенных на генетической карте. Следует иметь в виду, что встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ар или Тс (например PstI или BamHI), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам.


Прочие статьи:

Стволовые клетки взрослого организма
Полипотентные стволовые клетки присутствуют в некоторых тканях взрослого организма. Они служат источником клеток различных тканей, естественным образом выбывающих из строя. Эти клетки обнаружены не во всех типах тканей, но необходимо отме ...

Важность планирования семьи
Планирование дальнейшего деторождения в семье, в которой зарегистрирован случай наследственного заболевания, зависит от целого ряда факторов. Ведущую роль при этом играет уровень риска рождения больного ребенка. Генетический риск обычно I ...

Роль хроматина в жизни клетки
Хроматин - нуклеопротеид, комплекс белков с ДНК и РНК в ядрах клеток, обеспечивает упаковку сравнительно длинного фрагмента ДНК в значительно меньшее по размерам ядро. Хроматин - чрезвычайно сложный и динамичный комплекс и в живых клетках ...

Разделы