Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при покачивании, затем ополаскивают дистиллированной водой. Глицин, являясь слабым детергентом, повышает растворимость белков и способствует их отмыванию. Кроме того, отмыванию волос от биологических примесей способствует их предварительное выдерживание (1 - 2 ч) при низкой температуре (-20 ¸ -70 °С), а также в растворе абсолютированного спирта.
Основным критерием того или иного метода экстракции ДНК из волос, как и из других источников, служит количественный выход хорошо очищенной ДНК. Известно, что концентрация ДНК, выделяемой из луковичной части вырванных живых волос, может достигать 200 нг на один волос. В то же время содержание ДНК в фолликулах выпавших волос с отмершей луковицей уменьшается до 10 - 20 нг. Содержание же ДНК в стержневой части волоса практически невозможно измерить известными в настоящее время методами, в том числе методом УФ-спектроскопии или флуориметрии.
В данной работе эффективность метода экстракции ДНК оценивали путем проведения реакции амплификации на мини-сателлиты с парой праймеров системы Д1 S80, дающей после проведения амплификации специфические ДНК-фрагменты размером от 400 до 800 пар оснований.
Амплификацию проводили в следующем режиме:
94 °C - 4 мин;
94 °C ü
60 °C ý 30 циклов по 1 мин;
72 °C þ
72 °C - 8 мин.
Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, нанося по 25 мкл реакционной смеси, визуализировали в УФ-свете и документировали фотографированием. В качестве контроля амплификации использовали фрагменты ДНК с известной молекулярной массой.
Положительный результат реакции амплификации указывает на высокую степень очистки исследуемой ДНК. Особенно это важно при выделении ДНК из стержня волоса, содержащего много меланина. Известно, что значительное количество соединений различной химической природы способны ингибировать реакцию амплификации и даже полностью блокировать синтез ДНК в процессе амплификации. Процесс ингибирования ПЦР носит ярко выраженный концентрационный характер, т. е. увеличение концентрации ингибитора приводит к уменьшению выхода целевого продукта амплификации. Меланин полностью ингибирует ПЦР в концентрации 15 нг в 100 мл реакционной смеси. В хорошо очищенном экстракте не должно быть ингибирующего действия меланина.
Прочие статьи:
Цитогенетический метод
Цитогенетический метод основан на исследовании фотокариограммы – фотографии полного набора хромосом
1. Подсчет общего числа хромосом для определения видовой принадлежности.
2. Разбивка хромосом на пары. Используется правило индивидуальн ...
Влияние температуры
Современная биотехнология искусственного разведения осетровых рыб всецело зависит от температурного режима источников водоснабжения. По этой причине сроки работы с производителями, инкубация икры, подращивание личинок осетровых на действу ...
Лунные биоритмы
Лунные (циркулунарные) ритмы – их период в среднем 29,53 суток ѿ соответствуют циклу фаз луны, т.е. лунно-месячному циклу.
Средняя периодичность вращения Луны вокруг Земли влияет на многочисленные геофизическими изменения: например ...