Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при покачивании, затем ополаскивают дистиллированной водой. Глицин, являясь слабым детергентом, повышает растворимость белков и способствует их отмыванию. Кроме того, отмыванию волос от биологических примесей способствует их предварительное выдерживание (1 - 2 ч) при низкой температуре (-20 ¸ -70 °С), а также в растворе абсолютированного спирта.
Основным критерием того или иного метода экстракции ДНК из волос, как и из других источников, служит количественный выход хорошо очищенной ДНК. Известно, что концентрация ДНК, выделяемой из луковичной части вырванных живых волос, может достигать 200 нг на один волос. В то же время содержание ДНК в фолликулах выпавших волос с отмершей луковицей уменьшается до 10 - 20 нг. Содержание же ДНК в стержневой части волоса практически невозможно измерить известными в настоящее время методами, в том числе методом УФ-спектроскопии или флуориметрии.
В данной работе эффективность метода экстракции ДНК оценивали путем проведения реакции амплификации на мини-сателлиты с парой праймеров системы Д1 S80, дающей после проведения амплификации специфические ДНК-фрагменты размером от 400 до 800 пар оснований.
Амплификацию проводили в следующем режиме:
94 °C - 4 мин;
94 °C ü
60 °C ý 30 циклов по 1 мин;
72 °C þ
72 °C - 8 мин.
Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, нанося по 25 мкл реакционной смеси, визуализировали в УФ-свете и документировали фотографированием. В качестве контроля амплификации использовали фрагменты ДНК с известной молекулярной массой.
Положительный результат реакции амплификации указывает на высокую степень очистки исследуемой ДНК. Особенно это важно при выделении ДНК из стержня волоса, содержащего много меланина. Известно, что значительное количество соединений различной химической природы способны ингибировать реакцию амплификации и даже полностью блокировать синтез ДНК в процессе амплификации. Процесс ингибирования ПЦР носит ярко выраженный концентрационный характер, т. е. увеличение концентрации ингибитора приводит к уменьшению выхода целевого продукта амплификации. Меланин полностью ингибирует ПЦР в концентрации 15 нг в 100 мл реакционной смеси. В хорошо очищенном экстракте не должно быть ингибирующего действия меланина.
Прочие статьи:
В море есть такое чудо
В морях и на суше обитает великое множество удивительных существ. Среди жителей моря ученые обнаружили 125 тысяч видов моллюсков, к которым относятся осьминоги (самых больших из них называют спрутами), кальмары, каракатицы. Зоологи объеди ...
Недостаток фторидов и кариес зубов
Препараты, применяемые для профилактики кариеса зубов, представляют собой соединения фтора – фториды, которые содержатся в виде ионов, связанных с каким-либо катионом.
Фториды поступают в организм с водой, продуктами, лекарствами, пестиц ...
Условное торможение
Для внутреннего условного торможения характерно то, что оно такое же временное и условное, как и сам условный рефлекс. Оно вырабатывается, приобретается в индивидуальной жизни и играет особую роль в условнорефлекторной деятельности. Все в ...