Помимо последовательности ДНК, которую необходимо амплифицировать, смесь для ПЦР содержит буфер, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, два праймера, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом, и термостабильную ДНК-полимеразу Taq. Буфер для ПЦР, использующий 7-полимеразу, содержит 50 мм KG, 10 мм Трис-HCl, рН 8,4, 2,5 мм MgCl2 и 100 мкг/мл желатины. Желатина предпочтительнее БСА, так как она более устойчива к коагуляции на этапе денатурации и легко стерилизуется автоклавированием. Некоторые методики для нарушения вторичной структуры ДНК предусматривают использование 10%-ного диметилсульфоксида, хотя по нашему опыту это соединение в некоторой степени ингибирует полимеразу и снижает выход продукта амплификации. Если ДМСО все-таки применяется, для удобства следует приготовить 10-кратный исходный раствор и хранить его при — 20°С.
Нейтрализованные растворы трифосфатов можно приобрести у ряда коммерческих фирм. Затраты могут быть значительно снижены, если закупать лиофилизированные порошки и делать из них водные растворы. Прежде чем приступить к работе, эти растворы необходимо нейтрализовать гидроокисью натрия и точно развести, проверив концентрацию по УФ-поглощению. Для хранения готовят смесь всех трифосфатов и полученный 8 мм раствор замораживают при — 20°С.
Праймеры для ПЦР обычно имеют длину 20 нуклеотидов. Можно синтезировать и более длинные затравки, но они редко бывают необходимы. К 5'-концу праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную исследуемому образцу. Такие последовательности включаются в двухцепочечные продукты ПЦР, что обеспечивает возможность введения сайтов рестрикции или регуляторных элементов. Если о подлежащей амплификации последовательности имеется только ограниченная информация, можно использовать и более короткие праймеры с учетом поправки на изменение стабильности «посадки» праймера при температуре достройки. Препараты праймеров следует хранить в концентрации 10 мкм в ТЕ-буфере при —20°С.
Подбор эффективных праймеров для ПЦР — процесс эмпирический. Соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения праймеров, пригодных для использования.
1. Выбирайте праймеры с содержанием GC ~50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с протяженными полипуриновыми, полипиримидиновыми или другими неординарными последовательностями.
2. Избегайте последовательностей с устойчивыми вторичными структурами. Для изучения вторичной структуры очень полезны компьютерные программы, исходно разработанные для анализа вторичных структур РНК, и программы построения дот-матриц гомологии.
3. Проверьте затравки на комплементарность друг другу. Очевидно, что праймеры, отжигающиеся друг с другом, не смогут участвовать в амплификации интересующей последовательности.
Хотя большинство затравок с большей или меньшей эффективностью способно работать, бывают случаи, когда и синтезированные праймеры совершенно непригодны для амплификации желаемых последовательностей. Причина этого явления остается пока неясной. Во многих случаях простой сдвиг последовательности затравки на несколько оснований «вверх» или «вниз» решает проблему.
7а-7-полимеразу можно приобрести у ряда фирм. Для реакции ПЦР обычно используют фермент в концентрации 2 ед. в 100 мкл реакционной смеси. Для амплификации образцов ДНК, обладающих высокой кинетической сложностью, например, последовательностей геномной ДНК, оптимум концентрации Гад-полимеразы обычно 1-4 ед. на 100 мкл реакционной смеси. Увеличение количества фермента выше указанного уровня может привести к возрастанию уровня неспецифического синтеза и к уменьшению выхода требуемого фрагмента.
Прочие статьи:
Роль энтропии как меры хаоса
Появление теории самоорганизации в современном естествознании инициировано, видимо, подготовкой глобального эволюционного синтеза всех естественнонаучных дисциплин. Эту тенденцию в немалой степени сдерживало такое обстоятельство, как рази ...
Геологические эры и эволюция жизни
Органический мир развивался в течение миллиардов лет вместе с той средой, в которой ему приходилось существовать, т. е. вместе с Землей. Поэтому эволюцию жизни невозможно понять без эволюции Земли, и наоборот. Владимир Ковалевский (1842–1 ...
Возможные ошибки и варианты методики
В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную раз ...