Помимо последовательности ДНК, которую необходимо амплифицировать, смесь для ПЦР содержит буфер, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, два праймера, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом, и термостабильную ДНК-полимеразу Taq. Буфер для ПЦР, использующий 7-полимеразу, содержит 50 мм KG, 10 мм Трис-HCl, рН 8,4, 2,5 мм MgCl2 и 100 мкг/мл желатины. Желатина предпочтительнее БСА, так как она более устойчива к коагуляции на этапе денатурации и легко стерилизуется автоклавированием. Некоторые методики для нарушения вторичной структуры ДНК предусматривают использование 10%-ного диметилсульфоксида, хотя по нашему опыту это соединение в некоторой степени ингибирует полимеразу и снижает выход продукта амплификации. Если ДМСО все-таки применяется, для удобства следует приготовить 10-кратный исходный раствор и хранить его при — 20°С.
Нейтрализованные растворы трифосфатов можно приобрести у ряда коммерческих фирм. Затраты могут быть значительно снижены, если закупать лиофилизированные порошки и делать из них водные растворы. Прежде чем приступить к работе, эти растворы необходимо нейтрализовать гидроокисью натрия и точно развести, проверив концентрацию по УФ-поглощению. Для хранения готовят смесь всех трифосфатов и полученный 8 мм раствор замораживают при — 20°С.
Праймеры для ПЦР обычно имеют длину 20 нуклеотидов. Можно синтезировать и более длинные затравки, но они редко бывают необходимы. К 5'-концу праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную исследуемому образцу. Такие последовательности включаются в двухцепочечные продукты ПЦР, что обеспечивает возможность введения сайтов рестрикции или регуляторных элементов. Если о подлежащей амплификации последовательности имеется только ограниченная информация, можно использовать и более короткие праймеры с учетом поправки на изменение стабильности «посадки» праймера при температуре достройки. Препараты праймеров следует хранить в концентрации 10 мкм в ТЕ-буфере при —20°С.
Подбор эффективных праймеров для ПЦР — процесс эмпирический. Соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения праймеров, пригодных для использования.
1. Выбирайте праймеры с содержанием GC ~50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с протяженными полипуриновыми, полипиримидиновыми или другими неординарными последовательностями.
2. Избегайте последовательностей с устойчивыми вторичными структурами. Для изучения вторичной структуры очень полезны компьютерные программы, исходно разработанные для анализа вторичных структур РНК, и программы построения дот-матриц гомологии.
3. Проверьте затравки на комплементарность друг другу. Очевидно, что праймеры, отжигающиеся друг с другом, не смогут участвовать в амплификации интересующей последовательности.
Хотя большинство затравок с большей или меньшей эффективностью способно работать, бывают случаи, когда и синтезированные праймеры совершенно непригодны для амплификации желаемых последовательностей. Причина этого явления остается пока неясной. Во многих случаях простой сдвиг последовательности затравки на несколько оснований «вверх» или «вниз» решает проблему.
7а-7-полимеразу можно приобрести у ряда фирм. Для реакции ПЦР обычно используют фермент в концентрации 2 ед. в 100 мкл реакционной смеси. Для амплификации образцов ДНК, обладающих высокой кинетической сложностью, например, последовательностей геномной ДНК, оптимум концентрации Гад-полимеразы обычно 1-4 ед. на 100 мкл реакционной смеси. Увеличение количества фермента выше указанного уровня может привести к возрастанию уровня неспецифического синтеза и к уменьшению выхода требуемого фрагмента.
Прочие статьи:
Панорама современного естествознания
Фундаментом естественнонаучной картины мира (ЕНКМ) являются общие понятия:
· Материя
· Движение
· Время
· Пространство
· Взаимодействие
Материя(физ.) – это все то, что прямо или косвенно (опосредованно) воздействует на органы чувств ...
Каково происхождение разновидностей мерцательного эпителия и
в чем особенности их строения, связанные со спецификой выполняемой ими функции?
Где находится в организме мерцательный эпителий? Ответ ил
Мерцательный эпителий (однослойный многорядный реснитчатый эпителий) содержит включения: бокаловидные железы, продуцирующие слизь, которые оклеивают частицы пыли; бактерии образуют конгломераты, которые удаляются в результате колебания ре ...
Аминоспирты
Алифатические соединения, содержащие амино- и гидрокси- группы, называемые аминоспиртами, классифицируют согласно взаимному расположению этих функциональных групп. 1,1-Аминоспирты — соединения достаточно нестабильные, не встречающиеся в п ...