Методика, описанная в этом разделе, предназначена для проведения амплификации однокопийной последовательности ДНК длиной до 500 п. н. Детали ее могут быть изменены в соответствии с целями эксперимента. Реакционная смесь в объеме 100 мкл включает 1 мкг геномной ДНК человека, 1-кратный солевой буфер, 1 мм каждого праймера, 0,2 мм каждого dNTP и 2,5 единиц Гад-полимеразы. В приведенном частном примере район, а также с помощью гибридизации с олигонуклеотидными пробами. Теперь для этого разработан метод секвенирования амплифицированной ДНК без предварительного ее клонирования.
Прямое секвенирование имеет два важных преимущества перед традиционным клонированием фрагментов ПЦР в плазмидных и вирусных геномах.
1. Эту процедуру проще стандартизовать, так как ее проводят in vitro и она не зависит от живых систем. 2. Метод более быстр и надежен, поскольку в норме достаточно проанализировать единственную последовательность для каждого образца. Если же мы имеем дело с клонированными ПЦР-последовательностями, то для одного образца их нужно проанализировать несколько, чтобы отличить мутации, происшедшие в исходной геномной последовательности, от случайных ошибок при достройке ДНК-полимеразой в реакции ПЦР.и таких артефактов полимеразной реакции, как образование мозаичных аллелей вследствие рекомбинации in vitro.
Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности и 2) способом получения образца, приемлемого для секвениро-вания. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод. Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель.
В конечном счете, если эти осложнения никак более не удается преодолеть, можно при секвенировании использовать внутренние праймеры, отжигающиеся только на интересующей последовательности.
Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов.
Прочие статьи:
Приобретение знаний
Формальная логика изучает возможности установления истинности или ложности суждений, независимо от тех конкретных объектов, к которым эти суждения относятся. Логика формирует необходимые условия получения правильных выводов, с тем чтобы и ...
Основы строения волоса, микроскопирование объекта
Прежде чем приступить к выделению ДНК из исследуемого волоса, необходимо провести его микроскопирование и установить наличие или отсутствие луковицы волоса, а также по виду луковицы определить, живой или отмерший волос представлен на иссл ...
Сморчки и строчки
Сморчковые грибы, группа сумчатых грибов. Плодовые тела объёмистые, маломясистые, хрупкие, состоят из шляпки и ножки. Поверхность шляпки, выстланная спороносным слоем, ячеистая, извилистая, волнистая или гладкая. Ряд родов; наиболее извес ...