Амплификация геномной последовательности «вручную»

Статьи » Полимеразная цепная реакция » Амплификация геномной последовательности «вручную»

Методика, описанная в этом разделе, предназначена для проведения амплификации однокопийной последовательности ДНК длиной до 500 п. н. Детали ее могут быть изменены в соответствии с целями эксперимента. Реакционная смесь в объеме 100 мкл включает 1 мкг геномной ДНК человека, 1-кратный солевой буфер, 1 мм каждого праймера, 0,2 мм каждого dNTP и 2,5 единиц Гад-полимеразы. В приведенном частном примере район, а также с помощью гибридизации с олигонуклеотидными пробами. Теперь для этого разработан метод секвенирования амплифицированной ДНК без предварительного ее клонирования.

Прямое секвенирование имеет два важных преимущества перед традиционным клонированием фрагментов ПЦР в плазмидных и вирусных геномах.

1. Эту процедуру проще стандартизовать, так как ее проводят in vitro и она не зависит от живых систем. 2. Метод более быстр и надежен, поскольку в норме достаточно проанализировать единственную последовательность для каждого образца. Если же мы имеем дело с клонированными ПЦР-последовательностями, то для одного образца их нужно проанализировать несколько, чтобы отличить мутации, происшедшие в исходной геномной последовательности, от случайных ошибок при достройке ДНК-полимеразой в реакции ПЦР.и таких артефактов полимеразной реакции, как образование мозаичных аллелей вследствие рекомбинации in vitro.

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности и 2) способом получения образца, приемлемого для секвениро-вания. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод. Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель.

В конечном счете, если эти осложнения никак более не удается преодолеть, можно при секвенировании использовать внутренние праймеры, отжигающиеся только на интересующей последовательности.

Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов.


Прочие статьи:

Новая иммунная теория старения
Оригинальными российскими исследованиями показано, что в современном многоклеточном организме существует специальная система регуляции клеточного роста любых соматических пролиферирующих клеток, представленная, в частности, субпопуляциями ...

Липиды молока
Липиды молока представлены собственно молочным жиром, фосфолипидами и стероидами. Молочный жир – смесь сложных эфиров трехатомного спирта глицерина и жирных кислот, в нем преобладают олеиновая кислота из ненасыщенных, пальмитиновая, стеар ...

Ароматические аминокислоты нервной ткани и их метаболизм
Ароматические аминокислоты - триптофан, фенилаланин и тирозин - важны как предшественники 5-гидрокситрилтамина и катехоламинов, играющих чрезвычайно важную роль в нейрональных процессах. Триптофан является незаменимой аминокислотой и не ...

Разделы