Методика, описанная в этом разделе, предназначена для проведения амплификации однокопийной последовательности ДНК длиной до 500 п. н. Детали ее могут быть изменены в соответствии с целями эксперимента. Реакционная смесь в объеме 100 мкл включает 1 мкг геномной ДНК человека, 1-кратный солевой буфер, 1 мм каждого праймера, 0,2 мм каждого dNTP и 2,5 единиц Гад-полимеразы. В приведенном частном примере район, а также с помощью гибридизации с олигонуклеотидными пробами. Теперь для этого разработан метод секвенирования амплифицированной ДНК без предварительного ее клонирования.
Прямое секвенирование имеет два важных преимущества перед традиционным клонированием фрагментов ПЦР в плазмидных и вирусных геномах.
1. Эту процедуру проще стандартизовать, так как ее проводят in vitro и она не зависит от живых систем. 2. Метод более быстр и надежен, поскольку в норме достаточно проанализировать единственную последовательность для каждого образца. Если же мы имеем дело с клонированными ПЦР-последовательностями, то для одного образца их нужно проанализировать несколько, чтобы отличить мутации, происшедшие в исходной геномной последовательности, от случайных ошибок при достройке ДНК-полимеразой в реакции ПЦР.и таких артефактов полимеразной реакции, как образование мозаичных аллелей вследствие рекомбинации in vitro.
Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности и 2) способом получения образца, приемлемого для секвениро-вания. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод. Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель.
В конечном счете, если эти осложнения никак более не удается преодолеть, можно при секвенировании использовать внутренние праймеры, отжигающиеся только на интересующей последовательности.
Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов.
Прочие статьи:
Хозяйственная деятельность. Структурные
подразделения
Амурское областное общество охотников и рыболовов входит в состав Российской ассоциации общественных объединений охотников и рыболовов, их союзов, предприятий и организаций (Рисунок 14).
Органами управления структурного подразделения явл ...
Понятие о cтволовых клетках
Cтволовые клетки могут давать начало любым клеткам оpганизма – и кожным, и неpвным, и клеткам кpови. Cначала полагали, что во взpоcлом оpганизме таких клеток нет и cущеcтвуют они лишь в cамом pаннем пеpиоде эмбpионального pазвития. Однако ...
Жиры и липоиды.
Жиры представляют собой соединения жирных высокомолекулярных кислот и трехатомного спирта глицерина. Жиры не растворяются в воде – они гидрофобны. В клетке всегда есть и другие сложные гидрофобные жироподобные вещества, называемые липоида ...