В основе гистохимических методов выявления нуклоиновых кислот лежат реакции на все компоненты, входящие в их состав. В растущих тканях происходит быстрое обновление пуринов, пиримидинов, фосфорных соединений и Сахаров. Этим пользуются для избирательного выявления в них ДНК авторадпографическим методом с помощью 3Н-тимпдпна. ДНК образует соли с щелочноземельными и тяжелыми металлами. Остатки фосфорной кислоты, которые обычно связаны с ядерными белками (чаще всего гистонами), при вытеснении последних легко вступают в химические реакции с основными красителями. Для этого могут быть использованы сафранин О, янус зеленый В, толуидиновый синий, тионин, азур А и не которые другие красители, разведенные растворы которых в уксусной кислоте избирательно окрашивают хроматин. Для количественного гистохимические определения ДНК рекомендуется метод с применением галлоцианин-хромосовых квасцов, который обладает двумя ценными качествами. Галлоцианинхромовые квасцы дают устойчивую окраску, которая не меняется при обезвоживании и просветлении срезов в ксилоле. Окрашивание можно проводить при любом значении рН от 0,8 до 4,3, однако рекомендуется работать при оптимальном значении рН для этого красителя — 1,64, так как при нем происходит максимальное специфическое выявление ДНК. При окрашивании галлопианинхромовыми квасцами ДНК соединяется с красителем в стехиометрическом соотношении, причем отношение краситель: ДНК составляет 1:3,7.
Наиболее распространенной реакцией на ДНК считается реакция Фейльгена. Она проводится после мягкого гидролиза предварительно фиксированной ткани в 1 и. НС1 при 60°, в результате чего от дезоксирибозофосфата отщепляются пурины, а затем и ппрпмпдины, освобождая тем самым реакционноспособные альдегидные группы, которые реактивом Шиффа окрашиваются в красный цвет. Время гидролиза зависит от природы объекта и метода фиксации. Для получения хороших результатов необходимо в каждом отдельном случае время гидролиза подбирать экспериментально.
Для проверки специфичности реакции Фейльгена существует метод ферментативного и кислотного экстрагирования ДНК. Ферментативное расщепление ДНК проводят дезоксирибонукдеазой при концентрации ферментного препарата 2 мг на 100 мл 0,01 М трисбуфера рН 7,6; раствор перед употреблением разводят диетической водой в соотношении 1:5. Рекомендуется инкубировать срезы при 37° в течение 2 час. Другим способом удаления ДНК служит обработка гистохимических препаратов 5% водным раствором трихлоруксуснои кислоты в течение 15 мин. при 90° или 10% горячей (70°) хлорной кислотой в течение 20 мин., после чего реакция Фейльгена должна дать отрицательные результаты.
Прочие статьи:
Секвестрование двухцепочечных образцов
Для приготовления двухцепочечных образцов, используемых при секвенировании, выберите одну из двух методик.
1. Денатурируйте образец NaOH, перенесите в лед, нейтрализуйте реакцию, после чего быстро осадите ДНК- Растворите ДНК в буфере, со ...
Биосинтез и распределение мембранных липидов
В мембранах эукариотических клеток обнаружено огромное количество разных липидов, причем они не распределены равномерно по разным клеточным мембранам. Эта неравномерность относится к распределению как полярных головок, так и ацильных хвос ...
Паразиты лососевых рыб, и их классификация
Антропогенное загрязнение, изменение химических, гидрологических, климатических и других абиотических и биотических факторов cреды приводят к различным нарушениям в физиологии и ослабляют резистентность организма рыб, что способствует раз ...