Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Статьи » Геномная дактилоскопия » Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. Если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ9 имп./мин/мкг ДНК матрицы. Однако, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, поэтому лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.


Прочие статьи:

Роль коры больших полушарий в регуляции лактации
По данным Протасова Б.И. (1988), кора больших полушарий имеет прямой контакт с латеральным, маммилярным, вентромедиальным и паравентрикулярным ядрами гипоталамуса, в которых образуются рилизинг-гормоны либерины. В случае удаления влияния ...

Время появления сапиенса
Более распространено мнение о средне- или ранневерхнеплейстоценовом времени появления линии сапиенса. В качестве вероятного предка в этом случае у разных авторов фигурируют различные формы: или один из поздних прогрессивных эректусов (Вер ...

Происхождение вирусов
Вопросы происхождения вирусов обсуждаются на протяжении всего времени, начиная с момента их открытия, поскольку необходимость рациональных объяснений эволюции вирусов определяется фундаментальным и практическим значением этих структур. О ...

Разделы