Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. Если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ9 имп./мин/мкг ДНК матрицы. Однако, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, поэтому лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.
Прочие статьи:
Влияние дарвинизма на развитие биологии
На основе дарвинизма перестраивались все отрасли биологической науки. Палеонтология стала выяснять пути развития органического мира; систематика - родственные связи и происхождение систематических групп; эмбриология - устанавливать общее ...
Основные
свойства цитоплазмы
Физико-химические свойства цитоплазмы. Цитоплазма, представляющая собой основную массу протопласта (за вычетом ядра, митохондрии и пластид), имеет сложное строение, детали которого до сих пор еще не выяснены. Она состоит из большого колич ...
Методология современной биологии
У современной биологии появились новые стратегические направления развития исследовательской деятельности, а именно проектирование, конструирование биообъектов, управление живыми системами, прогнозирование. Это отразилось в таких направле ...