Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Статьи » Геномная дактилоскопия » Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. Если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ9 имп./мин/мкг ДНК матрицы. Однако, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, поэтому лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.


Прочие статьи:

Открытые системы и неравновесная термодинамика.
Неравновесная термодинамика открытых систем изучает существенно неравновесные процессы. В их описании ключевую роль играет понятие возрастания энтропии системы за счет процессов, происходящих внутри нее. Такой подход привел к новому взгля ...

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
Простота разделения сегментов ДНК путем клонирования и их последующий анализ позволили определить нуклеотидную последовательность многих ДНК. Но хотя стремление биологов к получению точных в химическом отношении данных продолжало стимулир ...

Средства индивидуальной защиты
Средствами индивидуальной защиты в лесу при нападении диких зверей и для обеспечения безопасности во время проведения рейдов является: холодное и огнестрельное оружие. Также при химическом и бактериологическом заражении местности, к сред ...

Разделы