Условия эксперимента.

Бактериальные штаммы

. Исследования проводили с L-лейцин-зависимым штаммом факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, продуцентом L-фенилаланина. Штамм был получен из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Для приготовления питательных сред с различным содержанием дейтерия в них (см. табл.1) использовали безводные соли квалификации “х.ч.”, D2O (99,9% D) и СD3ОD (97,5 %D), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости тяжелую воду очищали от вредных примесей, перегоняя ее над перманганатом калия. Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША) и диазометан. Диазометан получали из N-нитрозометилмочевины (Мerck, Германия).

Культивирование штамма В. methylicum проводили на минимальных средах М9 [11] как описано в работе [10].

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайя и Дайера [12].

Щелочной гидролиз белка

. Белок (4-5 мг) гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 5 мл 4 н. Ba(OH)2 в течение 24 ч при 110 0С. Гидролизаты суспендировали в 20 мл горячей дист. воды и нейтрализовали 2 н. раствором H2SO4 с последующим отделением осадка центрифугированием (10 000 об/мин, 5 мин). Гидролизаты упаривали в роторном испарителе при 400 С.

Получение дансиламинокислот культуральной жидкости

. К 200 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости в 5 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-3 моль) рН 9-10 дробными порциями при перемешивании добавляли 320 мг (1,2 10-3 моль) дансилхлорида в 5 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 400 С в течении часа, затем подкисляли 2 м. раствором HCL до рН 3,0 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

Дансиламинокислоты в составе белковых гидролизатов B. methylicum получали как описано в работе [9].

Получение метиловых эфиров дансиламинокислот

. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе культуральной жидкости и гидролизатов белка биомассы.

Количественное определение L-фенилаланина в культуральной жидкости проводили на спектрофотометре“Beckman DU-6” (США) при 540 нм после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином, как указано в работе [10].

Масс-спектры электронного удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.


Прочие статьи:

Возможные ошибки и варианты методики
В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную раз ...

Онтогенез и стабилизирующий отбор
Морфологическая эволюция онтогенеза не может быть понята, исходя из одних лишь ее адаптивных результатов, т. е. из простого сопоставления «готовых» типов нормального развития. В ее основе лежит процесс эволюции формообразовательных механи ...

Двудольные раздельнолепестные. семейство крестоцветные
Общие признаки. Цветок правильный, с двойным околоцветником. Чашечка имеет 4 чашелистика в 2 кругах. Венчик раздельнолепестный, из 4 лепестков. Тычинок 6, в 2 кругах: 2 короткие и 4 длинные. Пестик 1, завязь верхняя. Строение цветка можно ...

Разделы