Классическое генетическое картирование основывается на получении определенных мутаций и анализе частот рекомбинаций. У Drosophila генетические карты удалось расширить и уточнить путем установления корреляций между генетическими данными и хромосомными аберрациями типа делеций, инверсий и транслокаций, которые визуально проявляются как изменения в характере исчерченности политенных хромосом. Однако подобные методы непригодны для анализа хромосом большинства растений и животных. Генетический анализ немногочисленных популяций с большим периодом генерации весьма затруднителен, поскольку политенность встречается редко, а хромосомы довольно многочисленны, имеют небольшие размеры и с трудом поддаются идентификации. Например, у млекопитающих установление корреляции между фенотипическими изменениями и делециями, транслокациями и инверсиями позволяет локализовать лишь ограниченное число генов в специфических хромосомах или отдельных их областях. С развитием методов получения клонированных сегментов ДНК были разработаны универсальные процедуры картирования, которые не зависят от фенотипического проявления мутаций. Удалось локализовать многие гены, в том числе и гены человека, в специфических областях хромосом.
Мы рассмотрим два наиболее распространенных метода. С помощью одного из них положение клонированного сегмента ДНК устанавливают по его способности гибридизоваться со специфическим участком в практически интактных хромосомах. Второй позволяет идентифицировать хромосому, которая несет определенную последовательность, путем гибридизации подходящего меченого зонда с гибридными клетками, содержащими различные наборы лишь из нескольких хромосом данного вида. В третьем методе, описанном во введении к ч. IV, используются клонированные фрагменты ДНК для выявления полиморфизма рестрикционных сайтов. Такой полиморфный маркер применяют затем в качестве генетического маркера для построения карт сцепления эукариотических хромосом - аналогично тому, как в классическом генетическом анализе используют фенотипические маркеры.
Картирование хромосом с помощью гибридизации. РНК-зонды или денатурированные ДНК-зонды могут гибридизоваться с соответствующими последовательностями денатурированной ДНК, входящими в состав хромосом с характерными морфологическими признаками. Положение радиоактивно меченного зонда определяют, нанеся на препарат, подготовленный для микроскопического исследования, чувствительную эмульсию; в том месте эмульсии, которое контактирует с гибридным участком, появляются темные зерна серебра. Проведя микроскопическое исследование всего препарата, можно локализовать зонд. Довольно точные данные удается получить в случае больших политенных хромосом Drosophila в основном благодаря тому, что положение темных областей можно соотнести с характером исчерченности хромосом.
Однако определение положения единичных генов в небольших и весьма многочисленных хромосомах растений и позвоночных путем гибридизации in situ затруднено по двум причинам. Во-первых, не всегда легко идентифицировать отдельные хромосомы.
Это зависит от их размера, положения центромеры и характерного рисунка из темных и светлых полос, образующегося после окрашивания фиксированных метафазных хромосом определенными красителями. Кроме того, сами полосы захватывают слишком большие отрезки ДНК. Например, 3"109 пар нулеотидов гаплоидного генома человека содержатся менее чем в 1000 различных полосах, а у растений это число даже меньше. В результате с помощью чувствительной эмульсии можно установить лишь, в какой области хромосомы находится интересующий нас сегмент. Более того, размер зерен серебра и его разброс уменьшают разрешающую способность примерно до 107 пар оснований.
Вторая проблема-чувствительность зондов. Масса одной копии фрагмента дуплексной ДНК длиной 1 т.п. н. составляет примерно 10-12 мкг. Радиоактивно меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, редко имеют удельную радиоактивность, значительно превышающую 108 расп. /мин на 1 мкг. Гибридизация такого зонда с одним сопоставимым сегментом в хромосоме дает только 10-4 расп. /мин на 1 мкг, или примерно один распад в неделю. Чтобы достичь необходимой чувствительности, следует одновременно использовать несколько специальных приемов. Например, чтобы получить зонды с удельной радиоактивностью примерно 109 расп. /мин на 1 мкг, можно провести ник-трансляцию с использованием в качестве субстрата 1251-5-йодСТР. Гибридизацию следует проводить в присутствии декстрансульфата, что увеличивает скорость процесса примерно в 100 раз, в результате чего усиливается сигнал. Число зерен также может возрасти, если одноцепочечные последовательности векторной ДНК, которые сцеплены с гибридизуемой эукариотической последовательностью в клонированном зонде, будут в свою очередь гибридизоваться с избытком молекул зонда. Для увеличения числа зерен серебра можно увеличить время экспозиции до нескольких недель. Таким способом удается определить положение единичных копий генов в специфических, но весьма обширных областях хромосом млекопитающих.
Прочие статьи:
Моделирование поверхности и методы определения
адсорбции. Дисперсные системы
В качестве модельных поверхностей при изучении адсорбции ПАВ обычно используют частицы латексов, причем чаще всего проводят исследования с полистирольными латексами. Реже используют другие латексы, например полиметилметакрилатные. Для эти ...
Мегамир
С точки зрения современной науки, мегамир
– взаимодействующая и развивающаяся система всех небесных тел.
Понятие «Вселенная» означает весь существующий материальный мир. Часть Вселенной доступная на данном уровне познания называется Мет ...
Объекты исследования
История заместительной энзимной терапии официнальными препаратами началась с применения экстракта поджелудочной железы (панкреатина) в виде порошка. При этом сразу обнаружились недостатки, низкая эффективность вследствие инактивации энзим ...