Хромосомная локализация
Страница 1

Классическое генетическое картирование основывается на получении определенных мутаций и анализе частот рекомбинаций. У Drosophila генетические карты удалось расширить и уточнить путем установления корреляций между генетическими данными и хромосомными аберрациями типа делеций, инверсий и транслокаций, которые визуально проявляются как изменения в характере исчерченности политенных хромосом. Однако подобные методы непригодны для анализа хромосом большинства растений и животных. Генетический анализ немногочисленных популяций с большим периодом генерации весьма затруднителен, поскольку политенность встречается редко, а хромосомы довольно многочисленны, имеют небольшие размеры и с трудом поддаются идентификации. Например, у млекопитающих установление корреляции между фенотипическими изменениями и делециями, транслокациями и инверсиями позволяет локализовать лишь ограниченное число генов в специфических хромосомах или отдельных их областях. С развитием методов получения клонированных сегментов ДНК были разработаны универсальные процедуры картирования, которые не зависят от фенотипического проявления мутаций. Удалось локализовать многие гены, в том числе и гены человека, в специфических областях хромосом.

Мы рассмотрим два наиболее распространенных метода. С помощью одного из них положение клонированного сегмента ДНК устанавливают по его способности гибридизоваться со специфическим участком в практически интактных хромосомах. Второй позволяет идентифицировать хромосому, которая несет определенную последовательность, путем гибридизации подходящего меченого зонда с гибридными клетками, содержащими различные наборы лишь из нескольких хромосом данного вида. В третьем методе, описанном во введении к ч. IV, используются клонированные фрагменты ДНК для выявления полиморфизма рестрикционных сайтов. Такой полиморфный маркер применяют затем в качестве генетического маркера для построения карт сцепления эукариотических хромосом - аналогично тому, как в классическом генетическом анализе используют фенотипические маркеры.

Картирование хромосом с помощью гибридизации. РНК-зонды или денатурированные ДНК-зонды могут гибридизоваться с соответствующими последовательностями денатурированной ДНК, входящими в состав хромосом с характерными морфологическими признаками. Положение радиоактивно меченного зонда определяют, нанеся на препарат, подготовленный для микроскопического исследования, чувствительную эмульсию; в том месте эмульсии, которое контактирует с гибридным участком, появляются темные зерна серебра. Проведя микроскопическое исследование всего препарата, можно локализовать зонд. Довольно точные данные удается получить в случае больших политенных хромосом Drosophila в основном благодаря тому, что положение темных областей можно соотнести с характером исчерченности хромосом.

Однако определение положения единичных генов в небольших и весьма многочисленных хромосомах растений и позвоночных путем гибридизации in situ затруднено по двум причинам. Во-первых, не всегда легко идентифицировать отдельные хромосомы.

Это зависит от их размера, положения центромеры и характерного рисунка из темных и светлых полос, образующегося после окрашивания фиксированных метафазных хромосом определенными красителями. Кроме того, сами полосы захватывают слишком большие отрезки ДНК. Например, 3"109 пар нулеотидов гаплоидного генома человека содержатся менее чем в 1000 различных полосах, а у растений это число даже меньше. В результате с помощью чувствительной эмульсии можно установить лишь, в какой области хромосомы находится интересующий нас сегмент. Более того, размер зерен серебра и его разброс уменьшают разрешающую способность примерно до 107 пар оснований.

Вторая проблема-чувствительность зондов. Масса одной копии фрагмента дуплексной ДНК длиной 1 т.п. н. составляет примерно 10-12 мкг. Радиоактивно меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, редко имеют удельную радиоактивность, значительно превышающую 108 расп. /мин на 1 мкг. Гибридизация такого зонда с одним сопоставимым сегментом в хромосоме дает только 10-4 расп. /мин на 1 мкг, или примерно один распад в неделю. Чтобы достичь необходимой чувствительности, следует одновременно использовать несколько специальных приемов. Например, чтобы получить зонды с удельной радиоактивностью примерно 109 расп. /мин на 1 мкг, можно провести ник-трансляцию с использованием в качестве субстрата 1251-5-йодСТР. Гибридизацию следует проводить в присутствии декстрансульфата, что увеличивает скорость процесса примерно в 100 раз, в результате чего усиливается сигнал. Число зерен также может возрасти, если одноцепочечные последовательности векторной ДНК, которые сцеплены с гибридизуемой эукариотической последовательностью в клонированном зонде, будут в свою очередь гибридизоваться с избытком молекул зонда. Для увеличения числа зерен серебра можно увеличить время экспозиции до нескольких недель. Таким способом удается определить положение единичных копий генов в специфических, но весьма обширных областях хромосом млекопитающих.

Страницы: 1 2 3


Прочие статьи:

макромир
Макромир и микромир - две специфические области объективной реальности, различающиеся уровнем структурной организации материи. Сфера макроявления - это обычный мир, в котором живет и действует человек (планеты, земные тела, кристаллы, бол ...

Углеводы молока
Лактоза – дисахарид, по питательным свойствам не уступает свекловичному сахару, подавляет гнилостные процессы в кишечнике, способствует развитию благоприятной микрофлоры, используется в основном как источник энергии. Образуется только в ...

Центры многообразия и происхождения культурных растений
Чем разнообразнее исходный материал, используемый для селекции, тем большие возможности дает он для отбора и гибридизации. Н.И. Вавилов указывал, что одним из условий, способствующих созданию нового сорта, служит исходное сортовое и видов ...

Разделы