Хромосомная локализация
Страница 2

Картирование хромосом, основанное на получении гибридных соматических клеток. Для локализации клонированного сегмента в определенной хромосоме используют межвидовые соматические гибриды. Обычно такие гибридные соматические клетки содержат полный набор хромосом одного вида и только одну или небольшое число хромосом второго вида. Чтобы судить о наличии данного гена в определенной донорной хромосоме, анализируют группу разных линий гибридных клеток и устанавливают корреляцию между присутствием тестируемого гена и наличием специфической хромосомы.

Гибридные соматические клетки образуются при 1) слиянии клеток двух разных видов;

2) слиянии клеток одного вида с мини-клетками другого, содержащими одну или несколько донорных хромосом;

3) трансфекции реципиентных клеток препаратом очищенных хромосом донора. Чтобы элиминировать неслившиеся донорные и реципиентные клетки, применяют соответствующие селективные условия. Например, донорные клетки могут проявлять чувствительность к определенным лекарственным веществам, а реципиентные клетки могут быть мутантами, растущими лишь в особых условиях. В присутствии таких препаратов и в среде HAT растут только гибридные клетки, несущие в донорной хромосоме функциональный ген тимидинкиназы.

Если отобранные гибридные клетки выращивать в неселективных условиях, то донорные хромосомы в конце концов утратятся в силу более или менее случайных причин. Но клоны гибридных клеток можно получить в любой момент и идентифицировать резидентные донорные хромосомы по характеру исчерченности, выявлению ранее картированных последовательностей ДНК или ферментативных маркеров либо с использованием всех трех методов. Таким способом можно получить банки различных линий гибридных клеток, каждая из которых содержит определенный набор донорных хромосом.

Альтернативный подход состоит в сохранении селективных условий. Поддерживая условия, благоприятные для данного гена, в течение многих клеточных генераций, можно получить линии клеток только с одной стабильной донорной хромосомой. Другой способ получения гибридных клеток с одной донорной хромосомой состоит в трансфекции препаратом, обогащенным этой хромосомой.

При конструировании гибридов возникает вопрос, какой из видов будет служить донором, а какой - реципиентом. Ответ на него обычно можно найти лишь экспериментальным путем. Как правило, гибридные клетки "человек-мышь" утрачивают хромосомы человека.

После идентификации чужеродных хромосом в соматических клетках гибридов используют три подхода, для того чтобы установить, присутствует ли тестируемый ген в определенной хромосоме. Первый основан на выявлении корреляции между наличием этой хромосомы и экспрессией тестируемого гена с образованием определенного продукта. Для этого измеряют ферментативную активность или выявляют взаимодействие со специфическими антителами; при этом необходимо, чтобы используемые методы позволяли различать продукты генов донорных и реципиентных клеток. Например, два белка-продукта генов могут иметь разную электрофоретическую подвижность, как, например, в случае галактокиназ грызунов и приматов. При втором подходе используют гибридизацию между клонированным зондом и набором хромосом гибрида in situ; этот подход имеет уже описанные ограничения. Третий и наиболее общий подход связан с идентификацией искомого гена путем отжига соответствующего ДНК - или РНК-зонда с ДНК, выделенной из гибридных клеток и перенесенной на нитроцеллюлозный фильтр. Отжиг с эндонуклеазными фрагментами часто позволяет выявить донорный ген во фрагментах, имеющих размеры, типичные для донорного генома, даже в тех случаях, если гены донора и реципиента являются перекрестно гибридизующимися. Поскольку трудно получить гибриды с одной донорной хромосомой, обычно исследуют целый набор гибридных клеток, которые содержат разные донорные хромосомы. Если этот набор достаточно обширен, то присутствие последовательности зонда обычно можно связать с присутствием определенной хромосомы.

Используют также гибридные соматические клетки, содержащие лишь часть определенной хромосомы донора. Например, некоторые линии донорных клеток содержат хромосому с делецией или хромосому, несущую небольшой транслоцированный участок из другой хромосомы, и за прошедшие годы были выделены и охарактеризованы многие линии гибридных клеток, содержащие делетированные или составные донорные хромосомы. Например, с помощью таких гибридных клеток гены тяжелой цепи иммуноглобулина человека были локализованы в положении 32 длинного плеча хромосомы 14. Были проанализированы две линии гибридных клеток мыши и человека, каждая из которых содержала одну из пары реципрокных транслокаций между хромосомой 14 и Х-хромосомой. Зонд, представляющий собой клонированный ген иммуноглобулина, гибридизовался только с ДНК из гибрида, содержащего часть хромосомы 14, соответствующую q32.

Страницы: 1 2 3


Прочие статьи:

Размножение насекомых
Насекомые раздельнополы. Половые железы у них парные. У самцов в брюшке расположены семенники, от которых отходят семяпроводы, впадающие в семяизвергательный канал. Яичники самок открываются в яйцеводы, которые ниже соединяются в единое в ...

Принцип энтропии в термодинамики
Нельзя закончить этот краткий очерк истории развития классической физики, не сказав несколько слов о науке, которая целиком была создана учеными XIX в., о термодинамике. В XVIII в. теплота представлялась в виде некоторой жидкости, общее ...

Биосинтез белка
Вся информация о структуре того или иного белка «хранится» в соответствующих генах в виде последовательности нуклеотидов и реализуется в процессе матричного синтеза. Сначала информация с помощью фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы перед ...

Разделы