Определение числа копий данной последовательности в геноме
Страница 3

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Определение числа копий данной последовательности в геноме

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Страницы: 1 2 3 


Прочие статьи:

Переход от биосферы к ноосфере
Превращение разума и труда человечества в геологическую силу планетного масштаба происходило в рамках биосферы, составной частью которой они являются. В.И.Вернадский в своих исследованиях неизменно подчёркивал, какое огромное воздействие ...

Ароматические аминокислоты нервной ткани и их метаболизм
Ароматические аминокислоты - триптофан, фенилаланин и тирозин - важны как предшественники 5-гидрокситрилтамина и катехоламинов, играющих чрезвычайно важную роль в нейрональных процессах. Триптофан является незаменимой аминокислотой и не ...

Уксусная угрица и другие
Героиня фильма, уксусная угрица - сущест­во безобидное. Живет себе в забродившем уксусе, никому не мешает. Исследователи любят использовать ее как модельный организм для разных опытов. Для этого доста­точно капнуть немного уксуса в крахма ...

Разделы