Определение числа копий данной последовательности в геноме
Страница 3

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Определение числа копий данной последовательности в геноме

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Страницы: 1 2 3 


Прочие статьи:

Выводы
Данная работа содержит несколько разделов, основным из которых является литературный обзор. В нем описываются основные методы получения уксусной кислоты микробиологическим синтезом. Так же в этом разделе представлено: химизм процесса микр ...

Мышление и его компоненты
Что же такое мышление в общем смысле? Вопрос этот по своей важности достоин того, чтобы стать основным вопросом философии. По всей видимости, суть мышления и является одной из его сторон. Можно было бы привести несколько страниц определен ...

Что такое ассимиляция и диссимиляция? Какие структуры в клетке принимают участие в осуществлении этих процессов? Приведите примеры постоянно происходящих изменений в различных тканях при сохранении
Между организмом и окружающей средой происходит обмен веществ и энергии. Этот обмен обеспечивает пластические и энергетические потребности организма. Энергию для поддержания жизнедеятельности организм получает из поступивших в него питате ...

Разделы