в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения
Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.
Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.
Прочие статьи:
Трансфекция ДНК с использованием фосфата кальция
Таблица. Растворы для DMGT
Среда для роста клеток
Используйте низкофосфатную среду для роста
клеток, такую, как DMEM
Селективная среда
2хНереэ-буфер
рН очень важен и должен быть проверен, если
раствор д ...
Стебель и его функции
Стебель (у деревьев – ствол, ветви и побеги) служит связующим звеном между корнями, через которые вода и минеральные вещества поступают в растение, и листьями, в которых синтезируются питательные вещества. Проводящие ткани стебля составля ...
Пенициллы
Род Пенициллиум (Penicillium) относится к порядку гифомицетов (Hyphomycetales) из класса несовершенных грибов (Deuteromycota). Естественное местообитание этих грибов – почва, они часто обнаруживаются на самых разных субстратах, главным об ...