в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения
Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.
Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.
Прочие статьи:
Несколько слов по поводу взаимоотношений неандертальцев и сапиенсов
Если прежде, когда в науке о происхождения человека преобладали взгляды о стадиальной эволюции: erectus - neanderthalensis - sapiens, более примитивный склад ума неандертальца не ставился под сомнение, то в современной антропологии четког ...
Биологические основы акклиматизации
Все работы по акклиматизации и зарыблению естественных водоемов и водохранилищ осуществляются в соответствии с Положением о порядке проведения работ по акклиматизации рыб, других водных организмов и зарыблению водоемов РФ под строгим конт ...
Антропологические методы оценки волос (цвет, форма,
цветность) и третичность волосяного покрова
Волосы имеются почти на всей поверхности кожи. Выделяют три вида волос: длинные (волосы головы, бороды, усов и др.), щетинистые (брови, ресницы и др.) и пушковые, располагающиеся на большинстве участков кожного покрова.
Рис. 2. Кутикул ...