в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения
Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.
Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.
Прочие статьи:
Дисциплинарная организация науки
Современная наука
– совокупность отдельных научных отраслей, которые по предмету своих исследований делятся на:
1.естесственные, изучающие природу, её законы, способы освоения природы (химия, физика, биология). Заняты фундаментальными и ...
Передвижение воды
Еще много лет назад было экспериментально показано, что в стебле вода и соли, поглощаемые корнями, поднимаются главным образом по трахеидам и сосудам ксилемы, а сахара и другие органические вещества движутся в ос-ном по ситовидным трубкам ...
Укоренение черенка в воде
Это метод укоренения черенков сенполий дает возможность наблюдать и контролировать процесс появления корней, но время укоренения увеличивается за счет двойной адаптации черенка к условиям прорастания (сначала к водной среде, а затем к пес ...