в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения
Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.
Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.
Прочие статьи:
Научная картина мира. Принципы и особенности ее развития
Естественнонаучная картина мира
– часть общей научной картины мира, включающая систему представлений о природе, складывающихся в результате синтеза достижений естественных наук. Она содержит представления о живой и неживой природе. В стр ...
Основные этапы трансформации представлений о месте
и роли биологии в системе научного познания
В современном представлении биология - совокупность наук о жизни во всем разнообразии проявления ее форм, свойств, связей и отношений на земле. В ходе развития биологии происходило расширения ее предмета исследования и увеличение роли в с ...
Выводы
1. Физиологически активные вещества по сравнению с водой, стимулируют более быстрое корнеобразование, а так же способствуют лучшему укоренению черенков.
2. Из исследованных нами физиологически активных веществ самым эффективным является ...