Определение числа копий данной последовательности в геноме
Страница 3

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Определение числа копий данной последовательности в геноме

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Страницы: 1 2 3 


Прочие статьи:

Педотурбации биогенные.
Среди множества турбационных процессов в дерново-подзолистых почвах преимущественное развитие получают процессы перемещения и перемешивания почвенной массы в пределах одного или нескольких горизонтов под действием животных и растительных ...

Роль эстрогенных гормонов
Половые гормоны по химической природе относятся к стероидам. Основным источником их образования является холестерин. К половым гормонам самки относятся эстрадиол и его производные – эстрон и эстриол, образующиеся в яичниках, прогестерон и ...

Класс Сцифоидные / Sciphozoa
Отряд Корнеротые медузы / Rizostomida Отряд Флагомедузы / Semaeostomeae Отряд Кубомедузы / Cubomedusae и др. Схема цикла развития у Сцифоидных медуз : Личинка-планула – почкующаяся сцифистома – стробила – эфира – взрослая медуза. У б ...

Разделы