Ген овальбумина присутствует в гаплоидном геноме курицы в единственном экземпляре, однако многие гены и некоторые другие сегменты ДНК встречаются в геноме множество раз. Типичными примерами геномов с многократно повторяющимися последовательностями ДНК являются эукариотические геномы. Иногда несколько копий в таком геноме бывают абсолютно идентичны, и тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК с меченым гомологичным зондом на электрофореграмме наблюдается одна полоса, четко видимая даже в том случае, когда количество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг. Обычно для обнаружения сегмента, представленного в геноме млекопитающих лишь однократно, требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление полосы при количестве ДНК 1 мкг и менее свидетельствует о том, что данный сегмент представлен в геноме многократно. Если разные копии последовательности различаются по одной или нескольким парам оснований, то у них могут быть и неодинаковые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В результате на радиоавтограмме будет присутствовать множество полос или она будет представлять собой одно размытое темное пятно; это зависит от числа копий повторяющейся последовательности.
а. Оценка числа копий с помощью гибридизации ДНК-ДНК
Число копий можно оценить, проведя денситометрический анализ радиоавтограммы. При этом для повышения точности в отдельные лунки на этой же пластине геля вносят известное количество немеченой клонированной ДНК как образец геномной ДНК. Плотность радиоавтографа линейно зависит от количества ДНК в геле, поскольку зонд присутствует в избытке. Сравнивая между собой эти показатели для геномной ДНК и ДНК стандарта, мы можем оценить число копий.
б. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНК
Более точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и именно с их помощью были получены первые данные о том, что эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.
Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если
С0 и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени t0 и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то скорость реакции описывается уравнением
Хотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом, кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется препарат геномной ДНК известного размера, который может служить стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если Na и Nb-размеры геномов а и b, то
 |
где С - число молей мононуклеотидов на 1 л, t - время в секундах.
Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как "Cot".
Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.
Прочие статьи:
Устойчивость к неблагоприятным факторам среды
Кроме описанных выше биологических факторов, препятствующих росту и развитию растений, существует еще целый ряд абиотических стрессорных воздействий, регулярно оказываемых природой на сельскохозяйственные культуры – это засухи, холод, жар ...
Проточное культивирование
Исследованиями Ю. Л. Игнатова было показано, что накапливаемая в процессе уксусная кислота снижает окислительную активность бактерий и уменьшает удельную скорость роста клеток. Этот факт позволил П. И. Николаеву с сотрудниками организоват ...
Связь адсорбции поверхностно-активных веществ на границе
жидкость-воздух с критическим параметром упаковки
Как и спирты с гидрофобными группами средней длины, поверхностно-активные вещества также адсорбируются на поверхности жидкость-воздух так, что полярные группы направлены в сторону воды, а гидрофобные части молекул — в сторону воздуха. На ...