Ген овальбумина присутствует в гаплоидном геноме курицы в единственном экземпляре, однако многие гены и некоторые другие сегменты ДНК встречаются в геноме множество раз. Типичными примерами геномов с многократно повторяющимися последовательностями ДНК являются эукариотические геномы. Иногда несколько копий в таком геноме бывают абсолютно идентичны, и тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК с меченым гомологичным зондом на электрофореграмме наблюдается одна полоса, четко видимая даже в том случае, когда количество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг. Обычно для обнаружения сегмента, представленного в геноме млекопитающих лишь однократно, требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление полосы при количестве ДНК 1 мкг и менее свидетельствует о том, что данный сегмент представлен в геноме многократно. Если разные копии последовательности различаются по одной или нескольким парам оснований, то у них могут быть и неодинаковые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В результате на радиоавтограмме будет присутствовать множество полос или она будет представлять собой одно размытое темное пятно; это зависит от числа копий повторяющейся последовательности.
а. Оценка числа копий с помощью гибридизации ДНК-ДНК
Число копий можно оценить, проведя денситометрический анализ радиоавтограммы. При этом для повышения точности в отдельные лунки на этой же пластине геля вносят известное количество немеченой клонированной ДНК как образец геномной ДНК. Плотность радиоавтографа линейно зависит от количества ДНК в геле, поскольку зонд присутствует в избытке. Сравнивая между собой эти показатели для геномной ДНК и ДНК стандарта, мы можем оценить число копий.
б. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНК
Более точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и именно с их помощью были получены первые данные о том, что эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.
Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если
С0 и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени t0 и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то скорость реакции описывается уравнением
Хотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом, кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется препарат геномной ДНК известного размера, который может служить стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если Na и Nb-размеры геномов а и b, то
 |
где С - число молей мононуклеотидов на 1 л, t - время в секундах.
Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как "Cot".
Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.
Прочие статьи:
Грибы - паразиты человека и животных, их строение и размножение
Существует около 100000 видов грибов, разнообразных по внешнему виду и строению. Среди грибов есть микроскопически малые и гигантские организмы. Продолжительность жизни грибов – от нескольких дней до десятков лет.
Грибы распространены во ...
Современные средства
накопления информации
Появление наскальных рисунков и надписей свидетельствует о стремлении человека еще в древние времена сохранить свои наблюдения, передать их потомкам. Позднее стали писать на глиняных пластинах, свитках папируса, а примерно полтора тысячел ...
Верхний палеолит. Homo sapiens
Неандертальского человека повсюду, где найдены его останки, в верхнем палеолите сменяет человек современного типа, Homo sapiens – неоантpoп.
В Европе верхнепалеолитических людей чаще всего называют кроманьонцами, по гроту Кроманьон во Фр ...