При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Морфология человека. Многообразие форм и факторов изменчивости
человека
Каждый человек морфологически уникален, так как неповторима наследственная программа, реализованная в его онтогенезе, специфичны и условия среды, контролирующие реализацию генотипа в фенотип. Среди морфологических индивидуальностей могут ...
Логика и закономерности развития науки. Современная научная картина мира. Дифференциация, интеграция и математизация в современной науке
Дифференциация
- создание новых научных отраслей в результате расчленения традиционных наук на новые (например, из некогда единой науки о живых организмах выделились экология, цитология, физиология, генетика). В свою очередь новая наука ...
Цитогенетический метод
Цитогенетический метод основан на исследовании фотокариограммы – фотографии полного набора хромосом
1. Подсчет общего числа хромосом для определения видовой принадлежности.
2. Разбивка хромосом на пары. Используется правило индивидуальн ...