При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Пример с сегрегационного анализа, проводимого с
помощью метода геномных отпечатков
Ниже приводится пример анализа наследования полос в геномных отпечатках отдельной широкой сибсовой ветви.
Из-за несовершенства агарозного геля при электрофорезе лучше ие использовать для считывания данных отпечатков компьютерную технику, ...
Устойчивость к неблагоприятным факторам среды
Кроме описанных выше биологических факторов, препятствующих росту и развитию растений, существует еще целый ряд абиотических стрессорных воздействий, регулярно оказываемых природой на сельскохозяйственные культуры – это засухи, холод, жар ...
Основные свойства живых клеток
Изучение живых клеток пролило свет на их жизненно важные функции. Было установлено, что последние можно разбить на четыре категории: подвижность, раздражимость, метаболизм и размножение.
Подвижность проявляется в различных формах: 1) вну ...