При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Экологическая обстановка в городе Новосибирске
Основными источниками загрязнений атмосферы города является автомобильный транспорт (до 66 %), ТЭЦ (до 25 %), коммунальные котельные (до 4 %), предприятия (до 4,5 %) и выбросы частного сектора (печные трубы). Ежегодно в воздушный бассейн ...
Аллогенные стволовые клетки
Трансплантация фетальных клеток печени была впервые произведена в 1961 году, и к настоящему времени имеется достаточный мировой опыт их применения.
Плюрипотентные клетки образуют две популяции. Первая представляет собой массу клеток, рас ...
Близнецовый метод
Исследуя близнецовые пары, генетики пытаются выяснить роль наследственности и факторов среды в формировании тех или иных фенотипических признаков.
Многоплодность считается атавистическим признаком человека. В среднем из всех новорожденны ...