При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Эволюция
Вопрос о происхождении и эволюционных связях Bac. anthracis с другими почвенными спорообразующими бациллами, в том число и с Вас. cereus, остается дискуссионным. Попытки в экспериментальных условиях превратить один вид микробов в другой з ...
Повышение урожайности
Современные селекционеры-биотехнологи ставят перед собой те же задачи, что и при традиционном кроссбридинге и других методах модификации генома: повышение урожайности; устойчивость к болезнетворным бактериям, грибкам и вирусам; способност ...
Камбиальные клетки
Давно извеcтно, что почти каждая ткань в оpганизме имеет запаc так называемых камбиальных клеток, котоpые пополняют ее клеточный cоcтав, поcтоянно тающий от функциональных пеpегpузок или болезней. Пpи cтоль пpиcтальном внимании к cтволовы ...