При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Другие
гипотезы
· По мнению самого С. Чаттерджи, древнейшей птицей является протоавис, а не археоптерикс. При этом ближайшими родственниками птиц являются триасовые цератозавры — группа тероподных динозавров, обладавшая рядом существенных особенностей, х ...
Механические свойства биологических тканей
Рассмотрим важнейшие механические свойства биологических тканей, благодаря которым осуществляются разнообразные механические явления
– такие, как функционирование опорно-двигательного аппарата, процессы деформаций тканей и клеток, распро ...
Жиры и липоиды.
Жиры представляют собой соединения жирных высокомолекулярных кислот и трехатомного спирта глицерина. Жиры не растворяются в воде – они гидрофобны. В клетке всегда есть и другие сложные гидрофобные жироподобные вещества, называемые липоида ...