При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Нахождение в природе
Фтор как химический элемент, – широко распространенный в природе не металл, который занимает 16 место среди элементов входящих в состав земной коры. Чаще всего в природе находится в виде труднорастворимых солей апатита, топаза, полевого ш ...
Анализаторы. Общая характеристика и строение
Сенсорная (чувствительная) информация играет очень важную роль в жизнедеятельности человека. Она поступает в нервную систему различными путями. Через кожный покров и от органов чувств идет поток внешней (экстероцептивной) информации, сигн ...
Биологическая характеристика белуги в связи со средой обитания и образом
жизни. Общая биология вида
Тип: Хордовые (Chordata)
Под тип: Черепные (Craniata)
Над класс: Челюсноротые (Gnathostomata)
Класс: Рыбы (Pisces)
Над отряд: Хрящевые ганоиды (Chondrostei)
Семейство: Осетровые (Acipenseridae)
Род: Белуги (Huso)
Вид: Белуга (Huso ...