При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Подготовка волоса к исследованию, оценка качества выделенной ДНК
Перед началом работы образцы исследуемых волос моют в дистиллированной воде 1 ч при легком покачивании (на качалке, на магнитной мешалке и т. п.). Волосы, загрязненные кровью, спермой или слюной, моют в 1% водном растворе глицина 1 ч при ...
Размножение
Енотовидные собаки на ДВ становятся половозрелыми в возрасте около 10 месяцев, а на Европейской территории половозрелость наступает в 9-11 месяцев. В Приморье и Приамурье большинство енотовидных собак залегают в зимние норы разнополыми па ...
Химия получения уксусной кислоты
В качестве исходного продукта для производства уксусной кислоты используется этиловый спирт (этанол), который получается обычно сбраживанием углеводов дрожжами, например Saccharomyces cerevisiae:
С6Н12О6 → 2С2Н5ОН + 2СО2
глюкоза э ...