При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Осветление
Для осветления в раствор уксусной кислоты добавляют бентонит и небольшое количество лимонной кислоты. После перемешивания осветленный раствор уксусной кислоты подают на фильтр-пресс. Фильтрацию осуществляют через фильтры с диатомовой земл ...
В удивительном мире бесхвостых амфибий
Если бы животным присуждались премии, лягушки вполне могли бы претендовать на первый приз за странность.
Причем достойным кандидатом могла бы быть не только крохотная кубинская лягушка, величиной с ноготь мизинца, и не камерунская лягушк ...
Обмен белков
После расщепления белков в пищеварительном тракте образовавшиеся аминокислоты всасываются в кровь. В кровь всасывается также незначительное количество полипептидов - соединений, состоящих из нескольких аминокислот. Из аминокислот клетки н ...