При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Царство растений. Лишайники
Лишайники разнообразны по внешнему виду и окраске. Они бывают кустистые, листоватые и накипные.
Тело лишайника – слоевище – единый организм, состоящий из гриба и водоросли, живущих в симбиозе. На грибных нитях иногда появляются присоски, ...
Концепция эволюции в биологии. Чарльз Дарвин - основоположник теории
эволюции.
Учение Дарвина - "Происхождения видов путем естественного отбора". Причины эволюции - борьба за существование и естественный отбор. Инструмент эволюции - изменчивость. При этом на первое место по значению для эволюции видов Дарви ...
Генная инженерия
Возникла в 70-80 годы 20 века. Генная инженерия – раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным конструированием новых несуществующих в природе сочетаний генов.
ЗАДАЧИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ: расшифровка структуры генов, синтез ге ...