При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Мышление с точки зрения психологии
Свое особое мнение по поводу мышления есть и у психологов. Психологи, как правило, применяют термин "мышление" в довольно узком смысле, однако это только вопрос терминологии, а не каких-то глубинных различий. С их точки зрения м ...
Минеральные соли.
Большая часть неорганических в-в клетки находится в виде солей в диссоциированном, либо в твердом состоянии. Концентрация катионов и анионов в клетке и в окружающей ее среде неодинакова. В клетке содержится довольно много К и очень много ...
Характеристика возбудителя. Морфологические свойства
Прочно заняв со временем новое экологическое место, бацилла стала самостоятельным паразитическим видом, сохранившим много сходных черт со своими предками сапрофитами (Колонин, 1970). Bac. anthracis — сравнительно крупная палочка (от 1 — 1 ...