При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Влияние освещенности, уровня и течения воды на белугу
Прозрачность воды зависит от содержания в толще воды неорганических и органических взвешенных частиц, а также мельчайших растительных и животных организмов. Чем больше в воде содержится взвешенных частиц и микроорганизмов, тем меньше ее п ...
Концентрирование уксусной кислоты
В столовом уксусе содержится 5—9% кислоты (в СССР) или 4% (США), получаемой из 10—13%-го уксуса. Уксус с концентрацией 20—30% кислоты получают путем вымораживания исходного раствора. Лед, который образуется в этом процессе, отбрасывается. ...
Развитие Земли. Образование
Солнечной системы
Галактики сформировались, по всей вероятности, спустя примерно 1 - 2 млрд лет после Большого Взрыва, а Солнечная система возникла приблизительно на 8 млрд лет позже. Ведь материя распределялась по пространству отнюдь не равномерно. Более ...