При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Структура вселенной
Систем самого высокого порядка – Метагалактика
– это доступное наблюдение части Вселенной, она представляет собой систему взаимодействия скоплений галактик, она имеет сетчатую («ячеистую») структуру, т.е. галактики расположены неравномер ...
Развитие эмбриона
Во время образования внезародышевых оболочек органы и системы эмбриона продолжают развиваться. В определенные моменты одна часть клеток зародышевых листков начинает делиться быстрее, чем другая, группы клеток мигрируют, а клеточные слои и ...
Классификация человеческих рас
Отличия рас человека от рас животных всегда были источником специфических трудностей их классификации. В конечном итоге классификация человеческих рас должна отразить родственные связи между ними. Степень родства устанавливается главным о ...