При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.
Прочие статьи:
Ориентирование на местности
Направление на юг можно определить по большому скоплению смолы на соответствующей югу стороне ствола хвойного дерева. В оврагах снег тает быстрее на южных склонах. Шире годичные кольца на пнях на южной стороне, мох нарастает на северной с ...
Значение стаи при миграциях и размножении.
Большая часть мигрирующих животных совершает миграции, собираясь в большие стаи, объединяющиеся в передвигающиеся скопления. Исходя из этого, можно полагать, что групповое поведение представляет собой важную адаптацию и при миграциях жи ...
Термодинамический анализ основной реакции. Исходные данные
Уравнение реакции: С2Н5ОН + О2 СН3СООН + Н2О
Температурный интервал 10 ÷ 60ºC (283 ÷ 333 К)
Шаг изменения температуры 10ºC
Таблица 5. Исходные данные
В-во
ni
,
кДж/моль
,
Дж/(моль*К)
А0
А1 ...