Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для проведения ПЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности, фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что ПЦР-метод может применяться только при наличии предварительно клонированных и секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых модификаций можно значительно расширить возможности метода ПЦР. В одном из вариантов можно выделить определенный ген, если известна аминокислотная последовательность лишь короткого участка соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры длиной 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 п. н. Вследствие вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с альтернативными основаниями в нужных положениях. После проведения ПЦР амплифицированный сегмент из 60 п. н. очищают с помощью гель-электрофореза или клонирования и используют в качестве зонда для идентификации интересующей нас последовательности при анализе библиотек геномной ДНК или кДНК.
Еще один пример универсальности метода ПЦР дает использование его для амплификации полной кДНК-копии мРНК исходя из данных последовательности одного небольшого участка либо соответствующего пептида, либо мРНК. Метод состоит в следующем. Суммарную мРНК копируют с образованием одноцепочечной кДНК, используя короткий рогу^Т) - праймер. Затем с помощью терминальной трансферазы к 3'-концу кДНК присоединяют "хвост"; разд.4.8); используя короткий рогу^С) - праймер, синтезируют вторую цепь ДНК. До этого момента никакой специфичности в отношении определенной мРНК не проявляется. На следующем этапе используют олигонуклеотидный праймер с такой же последовательностью, как и у короткого участка вблизи 3'-конца нужной нам мРНК. С помощью этого праймера и poly проводят ПЦР; специфичность оказывается достаточно высокой для получения практически чистого продукта, представляющего полноразмерную мРНК.
В другом варианте в 5'-концы праймеров включают последовательности, соответствующие какому-либо рестриктазному сайту. При отжиге с исходной матрицей они остаются неспаренными, но амплифицируемый фрагмент приобретает концевые рестриктазные сайты. Они могут оказаться полезными при последующем клонировании или включении в вектор для изучения экспрессии.
Применение ПЦР. Возможности метода ПЦР во всей полноте еще не раскрыты, но с его помощью уже удалось получить новые данные о структуре разных РНК, генов и геномов, а также о процессах, протекающих на геномном уровне. Одно из его очень важных применений состоит в определении характера мутаций. После того как ген клонирован, с помощью двух праймеров амплифицируют соответствующий геномный сегмент, полученный от разных особей данного вида. Секвенирование этого сегмента позволяет установить природу мутации, произошедшей в данном гене, или выявить полиморфизм, будь то замена одной пары оснований или делеция, инсерция или перестройка. Благодаря простоте метода с его помощью можно диагностировать генетические заболевания и проводить популяционно-генетические исследования. Используя праймеры, которые специфически ассоциируются с определенными мутантными формами гена, можно также классифицировать мутации.
С помощью зондов, комплементарных геномам таких инфекционных агентов, как вирусы и бактерии, могут быть идентифицированы геномы этих агентов на фоне значительного избытка ДНК клетки-хозяина. В частности, вполне реальной представляется диагностика СПИДа с помощью этого метода. Еще одно его применение состоит в анализе структуры продуктов реакций рекомбинации.
Одним из интересных и потенциально наиболее эффективных применений ПЦР является амплификация сегментов ДНК внутри отдельных клеток. Такие опыты проводились как на диплоидных клетках, так и на сперматозоидах человека. Использование сперматозоидов имеет особое значение для генетического анализа видов, включая человека, которые не могут подвергаться экспериментальному скрещиванию. Этот метод позволяет оценить частоту мейотической рекомбинации непосредственно в больших популяциях сперматозоидов, если использовать пару праймеров, специфичных в отношении полиморфных или мутантных форм сцепленных генов.
Прочие статьи:
Расчет модели реактора на ЭВМ
Для расчета был выбран ферментатор, действующий по схеме реактора идеального смешения. Ферментатор выполнен из нержавеющей стали и снабжен мешалкой, барботером и змеевиковым теплообменником. Ферментатор используется для проведения процесс ...
Охрана окружающей среды. Предмет охраны окружающей
среды
Охрана окружающей среды – это система мер, направленная на поддержание рационального взаимодействия между деятельностью человека и окружающей природой, обеспечивающая сохранение и восстановление природных богатств, рациональное использова ...
Тепловой баланс стадии синтеза. Исходные данные
Таблица 9. - Исходные данные
В-во
ni
,
кДж/моль
,
Дж/(моль*К)
А0
А1
А2
А3
А-2
СН3СООН
1
-431,8
282,4
-11,2
310,8
-244,7
78,4
0,42
Н2О
1
-241,8
188,7
30,2
6,7 ...