Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК
Страница 2

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК

Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для проведения ПЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности, фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что ПЦР-метод может применяться только при наличии предварительно клонированных и секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых модификаций можно значительно расширить возможности метода ПЦР. В одном из вариантов можно выделить определенный ген, если известна аминокислотная последовательность лишь короткого участка соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры длиной 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 п. н. Вследствие вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с альтернативными основаниями в нужных положениях. После проведения ПЦР амплифицированный сегмент из 60 п. н. очищают с помощью гель-электрофореза или клонирования и используют в качестве зонда для идентификации интересующей нас последовательности при анализе библиотек геномной ДНК или кДНК.

Еще один пример универсальности метода ПЦР дает использование его для амплификации полной кДНК-копии мРНК исходя из данных последовательности одного небольшого участка либо соответствующего пептида, либо мРНК. Метод состоит в следующем. Суммарную мРНК копируют с образованием одноцепочечной кДНК, используя короткий рогу^Т) - праймер. Затем с помощью терминальной трансферазы к 3'-концу кДНК присоединяют "хвост"; разд.4.8); используя короткий рогу^С) - праймер, синтезируют вторую цепь ДНК. До этого момента никакой специфичности в отношении определенной мРНК не проявляется. На следующем этапе используют олигонуклеотидный праймер с такой же последовательностью, как и у короткого участка вблизи 3'-конца нужной нам мРНК. С помощью этого праймера и poly проводят ПЦР; специфичность оказывается достаточно высокой для получения практически чистого продукта, представляющего полноразмерную мРНК.

В другом варианте в 5'-концы праймеров включают последовательности, соответствующие какому-либо рестриктазному сайту. При отжиге с исходной матрицей они остаются неспаренными, но амплифицируемый фрагмент приобретает концевые рестриктазные сайты. Они могут оказаться полезными при последующем клонировании или включении в вектор для изучения экспрессии.

Применение ПЦР. Возможности метода ПЦР во всей полноте еще не раскрыты, но с его помощью уже удалось получить новые данные о структуре разных РНК, генов и геномов, а также о процессах, протекающих на геномном уровне. Одно из его очень важных применений состоит в определении характера мутаций. После того как ген клонирован, с помощью двух праймеров амплифицируют соответствующий геномный сегмент, полученный от разных особей данного вида. Секвенирование этого сегмента позволяет установить природу мутации, произошедшей в данном гене, или выявить полиморфизм, будь то замена одной пары оснований или делеция, инсерция или перестройка. Благодаря простоте метода с его помощью можно диагностировать генетические заболевания и проводить популяционно-генетические исследования. Используя праймеры, которые специфически ассоциируются с определенными мутантными формами гена, можно также классифицировать мутации.

С помощью зондов, комплементарных геномам таких инфекционных агентов, как вирусы и бактерии, могут быть идентифицированы геномы этих агентов на фоне значительного избытка ДНК клетки-хозяина. В частности, вполне реальной представляется диагностика СПИДа с помощью этого метода. Еще одно его применение состоит в анализе структуры продуктов реакций рекомбинации.

Одним из интересных и потенциально наиболее эффективных применений ПЦР является амплификация сегментов ДНК внутри отдельных клеток. Такие опыты проводились как на диплоидных клетках, так и на сперматозоидах человека. Использование сперматозоидов имеет особое значение для генетического анализа видов, включая человека, которые не могут подвергаться экспериментальному скрещиванию. Этот метод позволяет оценить частоту мейотической рекомбинации непосредственно в больших популяциях сперматозоидов, если использовать пару праймеров, специфичных в отношении полиморфных или мутантных форм сцепленных генов.

Страницы: 1 2 


Прочие статьи:

Инвазионные болезни рыб
Инвазионные болезни вызывают возбудители, относящиеся к животному миру. Протозойные болезни, вызываемые одноклеточными животными — простейшими. · Костиоз, или костиазис Возбудитель костиоза – очень мелкий жгутиконосец костия – Costia ne ...

Систематика животных
Все животные; подразделялись Линнеем на следующие шесть классов по признаку строения дыхательной и кровеносной систем: черви, насекомые, рыбы, гады, птицы, звери. ...

Теоретические модели старения. Общая математическая модель старения Б. Гомперца
Первая осознанная четкая математическая модель старения была создана около 200 лет тому назад Б. Гомперцом (1825). Она до сих пор наиболее точно описывает смертность человека и, видимо, большинства других организмов. В основу ее было поло ...

Разделы