Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК
Страница 1

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК

На заре развития методов молекулярного клонирования применение альтернативных способов амплификации специфических сегментов ДНК или РНК, присутствующих в больших популяциях молекул, казалось маловероятным. Однако в настоящее время такой метод разработан и широко используется. Он получил название полимеразной цепной реакции. С его помощью можно получать микрограммы ДНК-копии сегментов ДНК или РНК, даже когда они присутствуют в препарате в виде единственной молекулы.

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных двум 3'-концам участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка ПЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов. Для осуществления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры.

Полимеразная цепная реакция. Для того чтобы амплифицировать какой-то сегмент ДНК, синтезируют два олигонуклеотидных праймера, каждый из которых комплементарен одному из двух 3'-концов участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. В ходе ПЦР-реакции необходимо копировать последовательность каждой из цепей, находящуюся между участками, с которыми спариваются олигонуклеотидные праймеры. После спаривания праймеров с денатурированной ДНК, содержащей амплифицируемый сегмент, осуществляют встречное удлинение праймеров с помощью ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Образующиеся дуплексные ДНК денатурируют, вновь спаривают с праймерами и проводят ДНК-полимеразную реакцию. Этот цикл может быть повторен примерно 60 раз с удвоением в каждом цикле количества дуплексного сегмента ДНК. За п циклов образуется 2" копий дуплексного сегмента, ограниченного праймерами.

Используя термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных бактерий Thermus aquaticus, можно осуществлять множество ПЦР-циклов при однократном введении фермента. Сначала смешивают ДНК, избыточное количество праймерных молекул, дезоксинуклеозидтрифосфаты и полимеразу. Цикл запускают, нагрев смесь до температуры, обеспечивающей денатурацию ДНК; затем охлаждают раствор до температуры, необходимой для отжига праймеров. Далее устанавливают температуру, при которой может происходить синтез ДНК. Весь процесс, который длится несколько часов, можно автоматизировать, используя нагреватели, работа которых регулируется с помощью компьютера.

Использование ДНК-полимеразы Т. aquaticus не только позволяет автоматизировать процесс, но дает и другое преимущество. Этот фермент наиболее активен в температурном интервале 70-75°С. При таких условиях спаривание олигонуклеотидных праймеров и ДНК происходит более специфично, чем при 37°С - оптимальный температуре для ДНК-полимеразы Е. coli. В результате ассоциация праймеров происходит более точно, что сводит к минимуму амплификацию нежелательных сегментов ДНК, особенно в присутствии всей геномной ДНК. Точность отжига повышается также при подборе оптимального температурного режима, ионной силы, длины праймера и его нуклеотидного состава. Специфичность может быть достаточно высокой, чтобы осуществлялась амплификация двух разных сегментов в одном и том же препарате ДНК в присутствии двух пар праймеров.

РНК можно амплифицировать с образованием дуплексной ДНК аналогичным образом с той лишь разницей, что в начале первого цикла необходимо синтезировать кДНК-копию РНК. Если РНК представлена молекулами мРНК, то роль одного из праймеров в ПЦР, а также в реакциях с участием обратной транскриптазы могут выполнять короткие рогу-цепочки.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Аспергиллы
Аспергиллы, так же как и пенициллы, относятся к классу несовершенных грибов. Естественное их местообитание – верхние горизонты почв, особенно в южных широтах, где их чаще всего обнаруживают на различных субстратах, главным образом растите ...

ДНК-рестриктазы и ДНК-метилазы
Это ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции- модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. ...

Непарный шелкопряд (семейство Волнянки)
Семейство вкл. Около 3000 видов. В России несколько десятков видов, преимущественно в лесной зоне, из них около 50 видов в Сибири. Непарный шелкопряд распространен в Западной Европе (кроме Крайнего Севера), Средиземноморье, Северной Монго ...

Разделы