Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК- лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и З'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Прочие статьи:
Сушкин Петр Петрович
Сушкин Петр Петрович(1868—1928) - видный русский ученый-зоолог. Широко известен как орнитолог, зоогеограф, анатом и палеонтолог.
Родился в Туле в купеческой семье 27 января (8 февраля) 1868 года. Среднее образование получил в Тульской кл ...
Семейные группы.
Образование семейных групп рассматривается как следствие описанного выше репродуктивного поведения у большинства птиц и млекопитающих, а также у некоторых видов рыб и членистоногих. Эти группы состоят из родителей (или одного из них) и ...
Параметры температурных циклов
Полимеразная цепная реакция предусматривает инкубацию образцов при трех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации, - денатурации, отжигу и достройке.
Обычно двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрев ...