Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК- лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и З'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Прочие статьи:
Влияние растворенных веществ на поверхностное натяжение
В водных системах растворенные вещества влияют на поверхностное натяжение тремя разными способами. Органические вещества, растворимые в воде обычно монотонно понижают поверхностное натяжение по мере увеличения концентрации благодаря преим ...
Основные
свойства цитоплазмы
Физико-химические свойства цитоплазмы. Цитоплазма, представляющая собой основную массу протопласта (за вычетом ядра, митохондрии и пластид), имеет сложное строение, детали которого до сих пор еще не выяснены. Она состоит из большого колич ...
Передача наследственной информации
Живая природа поражает нас многообразием форм, но отдельные биологические виды отличаются постоянством формы, воспроизводя ее снова и снова в неизменном виде. Это значит, что возникновение формы должно быть подчинено строгим правилам. Но ...