Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК- лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и З'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Прочие статьи:
Обмен веществ и преобразование энергии в клетке.
Все живые организмы способны к обмену веществ с окружающей средой. В клетках непрерывно идут процессы биологического синтеза, или биосинтеза. С помощью катализаторов химических реакций – ферментов – из простых низкомолекулярных веществ об ...
Механизмы регуляции молокообразования. Нервная
регуляция
В регуляции непосредственной секреторной функции молочной железы главную роль играют гормоны желез внутренней секреции. Это обусловлено тем, что молочная железа иннервируется только симпатическими нервами, которые обеспечивают афферентную ...
Основные этапы возникновения жизни
1. Образование простых органических соединений. На начальных этапах своей истории Земля представляла собой раскаленную планету (4 000 – 8 000 градусов). Но по мере ее остывания тяжелые химические элементы перемещались к центру, и впоследс ...