Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК- лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и З'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Прочие статьи:
Гипотезы эволюции человека. Основные гипотезы эволюции
человека в период становления Homo sapiens
Важнейшими аргументами в пользу теории «неандертальской фазы» служили следующие факты.
Во-первых, все сколько-нибудь достоверно датированные останки древних людей располагаются в определенной последовательности: неандертальцы всегда зале ...
Оксидазы, их участие в аэробном дыхании
Оксидазы – аэробные дегидрогеназы. для которых акцептором водорода может быть только кислород воздуха:
АН2+1/2О2 ↔ А+Н2О.
Ферменты оксидазы, которые активируют молекулярный кислород и делают его способным восстанавливаться до пере ...
Оксокислоты
Оксокислоты в природе распространены значительно меньше, чем гидроксикислоты, они редко встречаются в свободном состоянии, не накапливаются в организмах, хотя и образуются на различных стадиях биосинтеза. По поводу последнего факта нужно ...