Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных исследованиях находит ДНК-лигаза бактериофага Т4. Реакция лигирования протекает в два этапа. Вначале образуется промежуточный комплекс фермент-АМР (этап 1), после чего остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК (этап 2). Образовавшаяся фосфодиэфирная связь гидролизуется во время нуклеофильной атаки З'-ОН группы соседнего нуклеотида, что приводит к образованию новой фосфодиэфирной связи, восстанавливающей целостность сахаро-фосфатного остова ДНК. Т4-ДНК- лигаза осуществляет соединение фрагментов двухцепочечной ДНК, обладающих комплементарными "липкими" или "тупыми" концами. Как следует из механизма реакции, необходимым условием протекания лигирования является наличие 5'-концевого фосфата и З'-концевого гидроксила в точках разрыва цепей ДНК. При этом эффективность соединения фрагментов ДНК по "тупым" концам Т4-ДНК-лигазой возрастает в присутствии Т4-РНК-лигазы, которая осуществляет ковалентное соединение 5'-фосфорилированных концов одноцепочечных ДНК или РНК с З'-ОН группами одноцепочечных нуклеиновых кислот.
Прочие статьи:
Заготовка зелёных черенков смородины
В первую очередь черенкуют сорта раннего срока созревания, которые первыми заканчивают рост. Побеги заготавливают утром, переносят в затененное прохладное место, смачивают водой и острым ножом или секатором разрезают на черенки. Нижний ср ...
Распространение современного человека
В Африке были найдены более древние ископаемые остатки, чем на каком-либо из других континентов. Так, в Южной Эфиопии нашли Омо-I – неполный череп со многими современными признаками, возраст которого, вероятно, более 60 тысяч лет. В устье ...
Развитие первого мозгового пузыря (Telencephalon)
Конечный мозг, или первый мозговой пузырь (telencephalon), - это значительно расширенная и выступающая впереди и по бокам передняя часть первоначального переднего мозга. Его первоначально единый пузырь вскоре начинает преобразовываться, п ...