Описание эксперимента

Для получения рекомбинантного аденовируса CELO методом котрансформации с ДНК вируса CELO дикого типа сконструированная плазмида должна содержать правый и левый фрагменты ДНК указанного вируса. Мы использовали плазмиду pCBEl, содержащую правый концевой фрагмент генома вируса CELO от 88.8 доЮО единиц карты (ед. к.). Участок генома от 95,3 до 99,7 ед. к., который не является существенным для репликации вируса, был делетирован из pCBEl по сайтам рестриктазы EcoRV. Указанным способом была получена плазмида pCBEARV. Полученная плазмида была подвергнута гидролизу рестриктазой Hind3 с последующим дефосфорилированием, а затем обработке олигонуклеотидом , содержащим сайт распознавания рестриктазы Рас 1.

Левый фрагмент вируса CELO был клонирован в плазмиду pGEM-T путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды, содержащие следующие сайты рестрикции: первый - Bst и Pad, второй—Asc, Sfi и Есо721.Число циклов амплификации составило 15.

Следующий этап заключался в проведении гидролиза полученных плазмид; PacpCBEARV по сайту рестрикции Smal, CELOleftpGEM-T путем обработки рестриктазами Bstl 1071 и Есо721. Из полученных фрагментов была сконструирована плазмида, несущая правый и левый концы генома аденовируса CELO. Недостатком полученной плазмиды являлось наличие высококопийного ori ( ori—участок, в котором начинает расплетаться ДНК при помощи ДНК- полимеразы). Учитывая наличие двух сайтов рестрикции по Pad, ori было сменено при помощи рестрикции по указанным сайтам и последующим соединением липких концов образованного фрагмента с частью плазмиды pTG3601, гидролизованной также по двум сайтам Pad.

Полученная плазмида была рестриктирована по Ascl и котрансформирована с геномом вируса CELO по гомологичным участкам. Таким образом нами был получен Ad-вектор для экспрессии генов на основе генома аденовируса птиц CELO. Указанная схема представлена на рисунке 2.1.

2


Прочие статьи:

Теоретические модели старения. Общая математическая модель старения Б. Гомперца
Первая осознанная четкая математическая модель старения была создана около 200 лет тому назад Б. Гомперцом (1825). Она до сих пор наиболее точно описывает смертность человека и, видимо, большинства других организмов. В основу ее было поло ...

Гнезда птиц
А – кладка на земле без гнезда у козодоя и Б – кулика зуйка; В – гнездо на земле рябчика и Г – обыкновенной чайки; Д – яйцо кайры на голой скале; Е – гнездо моевки на скалистом уступе; Ж – императорский пингвин с яйцом на лапах; ...

Экологические группы почвенных организмов
Исходя из степени подвижности и размеров, вся почвенная фауна сгруппирована в следующие три экологические группы: Микробиотип, или микробиота (не путать с эндемиком Приморья – растением микробиотой перекрестнопарной!): организмы, предс ...

Разделы