Описание эксперимента

Для получения рекомбинантного аденовируса CELO методом котрансформации с ДНК вируса CELO дикого типа сконструированная плазмида должна содержать правый и левый фрагменты ДНК указанного вируса. Мы использовали плазмиду pCBEl, содержащую правый концевой фрагмент генома вируса CELO от 88.8 доЮО единиц карты (ед. к.). Участок генома от 95,3 до 99,7 ед. к., который не является существенным для репликации вируса, был делетирован из pCBEl по сайтам рестриктазы EcoRV. Указанным способом была получена плазмида pCBEARV. Полученная плазмида была подвергнута гидролизу рестриктазой Hind3 с последующим дефосфорилированием, а затем обработке олигонуклеотидом , содержащим сайт распознавания рестриктазы Рас 1.

Левый фрагмент вируса CELO был клонирован в плазмиду pGEM-T путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды, содержащие следующие сайты рестрикции: первый - Bst и Pad, второй—Asc, Sfi и Есо721.Число циклов амплификации составило 15.

Следующий этап заключался в проведении гидролиза полученных плазмид; PacpCBEARV по сайту рестрикции Smal, CELOleftpGEM-T путем обработки рестриктазами Bstl 1071 и Есо721. Из полученных фрагментов была сконструирована плазмида, несущая правый и левый концы генома аденовируса CELO. Недостатком полученной плазмиды являлось наличие высококопийного ori ( ori—участок, в котором начинает расплетаться ДНК при помощи ДНК- полимеразы). Учитывая наличие двух сайтов рестрикции по Pad, ori было сменено при помощи рестрикции по указанным сайтам и последующим соединением липких концов образованного фрагмента с частью плазмиды pTG3601, гидролизованной также по двум сайтам Pad.

Полученная плазмида была рестриктирована по Ascl и котрансформирована с геномом вируса CELO по гомологичным участкам. Таким образом нами был получен Ad-вектор для экспрессии генов на основе генома аденовируса птиц CELO. Указанная схема представлена на рисунке 2.1.

2


Прочие статьи:

Происхождение рас: теории моногенизма и полигенизма
В XVI-XVIII вв. моногенизм был тесно связан с церковной традицией, и общественное мнение видело в нем учение, укреплявшее догматы церкви о происхождении людей от Адама и Евы. Поэтому на позицию полигенизма становились все те, кто не хотел ...

Источники углерода для растений. Усвоение углекислоты и лучистой энергии солнца при фотосинтезе. Лист как орган фотосинтеза
Углекислый газ поступает в растения из воздуха, превращаясь с помощью лучистой энергии солнца в сложные, высокоэнергетические органические соединения, которыми питается животный мир. Животные, используя потенциальную энергию органических ...

ДНК-лигазы
Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является, наряду с рестрикцией, одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. Наибольшее применение в генно-инженерных иссл ...

Разделы