Описание эксперимента

Для получения рекомбинантного аденовируса CELO методом котрансформации с ДНК вируса CELO дикого типа сконструированная плазмида должна содержать правый и левый фрагменты ДНК указанного вируса. Мы использовали плазмиду pCBEl, содержащую правый концевой фрагмент генома вируса CELO от 88.8 доЮО единиц карты (ед. к.). Участок генома от 95,3 до 99,7 ед. к., который не является существенным для репликации вируса, был делетирован из pCBEl по сайтам рестриктазы EcoRV. Указанным способом была получена плазмида pCBEARV. Полученная плазмида была подвергнута гидролизу рестриктазой Hind3 с последующим дефосфорилированием, а затем обработке олигонуклеотидом , содержащим сайт распознавания рестриктазы Рас 1.

Левый фрагмент вируса CELO был клонирован в плазмиду pGEM-T путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды, содержащие следующие сайты рестрикции: первый - Bst и Pad, второй—Asc, Sfi и Есо721.Число циклов амплификации составило 15.

Следующий этап заключался в проведении гидролиза полученных плазмид; PacpCBEARV по сайту рестрикции Smal, CELOleftpGEM-T путем обработки рестриктазами Bstl 1071 и Есо721. Из полученных фрагментов была сконструирована плазмида, несущая правый и левый концы генома аденовируса CELO. Недостатком полученной плазмиды являлось наличие высококопийного ori ( ori—участок, в котором начинает расплетаться ДНК при помощи ДНК- полимеразы). Учитывая наличие двух сайтов рестрикции по Pad, ori было сменено при помощи рестрикции по указанным сайтам и последующим соединением липких концов образованного фрагмента с частью плазмиды pTG3601, гидролизованной также по двум сайтам Pad.

Полученная плазмида была рестриктирована по Ascl и котрансформирована с геномом вируса CELO по гомологичным участкам. Таким образом нами был получен Ad-вектор для экспрессии генов на основе генома аденовируса птиц CELO. Указанная схема представлена на рисунке 2.1.

2


Прочие статьи:

Роль стрессосом как факторов выживания микроорганизмов
О кризисных явлениях в окружающей среде большинству бактерий сигналит особый центр. Этот центр чаще всего является крупной молекулой и назван «стрессосомой». Как правило, бактерия имеет в своём составе около 20 стрессомом, и, хотя ученые ...

Определение положения клонированных сегментов в геномах
В идеале установление положения клонированного сегмента ДНК означает определение фланкирующих его последовательностей и того хромосомного сайта, по которому этот сегмент был включен в хромосому. Конечная цель такого картирования состоит в ...

Взаимодействие нервной и эндокринной системы
Тело человека состоит из клеток, соединяющихся в ткани и системы - все это в целом представляет собой единую сверхсистему организма. Мириады клеточных элементов не смогли бы работать как единое целое, если бы в организме не существовал сл ...

Разделы