Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
Наследственная
информация и регуляция у растений
Основное свойство образовывать один и тот же вид при развитии растения из воспроизводящей клетки, т. е. свойство наследственности, заключено в ядре и связано с ДНК.
Большое значение в регуляции функций организма играет цитоплазматическая ...
Естественная защита растений
Растения, как и животные, обладают врожденными механизмами защиты от различных насекомых и заболеваний. В настоящее время ученые ведут активный поиск соединений, которые активизировали бы эти естественные механизмы, не нанося при этом вре ...
Видовое единство человечества
Несмотря на неоднократные попытки доказать, что человеческие расы представляют собой разные виды и даже разные роды, все же подавляющее большинство исследователей определяет человечество как единый вид.
Видовое единство человечества може ...