Перенос хромосом

Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.

1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.

2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.

3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.

4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.

5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.

6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.

7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.

8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.

9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.

10. Колонии появятся на 14–21-й день.


Прочие статьи:

Глицин и пути его обмена
Глицин участвует не только в биосинтезе белков, но и в других многочисленных биосинтетических процессах, таких, как образование пуринов, порфиринов, креатина, этаноламина, холина, глутатиона и др. Глицин функционирует также в качестве инг ...

Основные закономерности роста человека
Изучение роста чрезвычайно важно для выяснения механизмов эволюции, так как эволюция морфологических признаков осуществляется всегда путем изменения генетически обусловленного роста и развития. Кроме того, изучение процесса роста существе ...

Структура кожи и ее механические свойства
До недавнего времени кожа привлекала недостаточное внимание исследователей. Ситуация стала меняться сравнительно недавно. Последние исследования привели к лучшему пониманию особенностей этого органа. Схематическое изображение разреза нор ...

Разделы