Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
Соматическая и функциональная антропология. Конституции
человека
Развитие конституционологии в последние сто лет шло сложными путями, переживало подъемы и спады, обусловливаемые как объективными, так и субъективными причинами.
Среди специалистов нет единого мнения о человеческой конституции, и мы усло ...
Взаимодействие нервной и эндокринной системы
Тело человека состоит из клеток, соединяющихся в ткани и системы - все это в целом представляет собой единую сверхсистему организма. Мириады клеточных элементов не смогли бы работать как единое целое, если бы в организме не существовал сл ...
Семейство таксодиевые. Род, виды и их характеристика
В семействе таксодиевые (Taxodiaceae) выделяют 15 видов 9 родов, из которых на территории нашей страны ни один вид естественно не растет. Как правило, таксодиевые – крупные (и очень крупные) быстро растущие деревья с ценной древесиной, ча ...