Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
Основные свойства живых клеток
Изучение живых клеток пролило свет на их жизненно важные функции. Было установлено, что последние можно разбить на четыре категории: подвижность, раздражимость, метаболизм и размножение.
Подвижность проявляется в различных формах: 1) вну ...
Практические аспекты сегрегационного анализа. Минимальный размер родословных
Для того чтобы сегрегационный анализ полос в отпечатках ДНК сибсов был информативным, необходимо изучить не менее 10 мейозов. Такое количество сибсов далеко не всегда доступно для изучения, и поэтому приходится проводить сегрегационный ан ...
От гипотезы до теории
Первая экспериментальная проверка гипотезы была предпринята А. Ходжкином и Б. Катцем в 1949 г. Исследователи решили посмотреть, как влияет на величину ПД изменение концентраций калия и натрия в наружной среде. Они показали, что амплитуда ...