Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
Размножение
Енотовидные собаки на ДВ становятся половозрелыми в возрасте около 10 месяцев, а на Европейской территории половозрелость наступает в 9-11 месяцев. В Приморье и Приамурье большинство енотовидных собак залегают в зимние норы разнополыми па ...
Адаптация к воде
Кожа касатки имеет свойство активно регулировать и снижать гидродинамическое сопротивление плаванию посредством взаимодействия кожного покрова с обтекающим потоком воды. Кожа самонастраивается и задерживает образование вихрей вокруг тела ...
Результаты исследований. Гнездовая биология
совообразных Брестской области
Все гнездовья сов обследовались 2-3 раза за сезон. За указанный период отмечено 57 случаев гнездования в искусственных гнездовьях четырёх видов: серой неясыти (n=11), ушастой совы (n=42), филина (n=3), мохноногого сыча (n=1). Окольцовано ...