Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
История изучения паразитарных инвазий рыб
Паразитология как наука в России долгое время не существовала, но уже к концу ХIX в. появляются крупные специалисты-паразитологи, изучающие определенные группы паразитов (простейших, гельминтов, членистоногих). Создаются школы паразитолог ...
Быстрый способ уксусного брожения
Впервые данный метод был описан немецким ученым Бургавом в 1732 году.
При этом способе, тайно разработанном в Германии и проданном в 1823 г. Шуценбахом, затор, содержащий этанол, стекает сверху вниз в башенном ацетаторе, сквозь большой с ...
Открытые системы и новая термодинамика.
Но классическая термодинамика не знакома со временем и пространством: она признает только такие понятия, как покой (равновесие), для которого не существует времени, и однородность, для которой безразлична протяженность в пространстве. Это ...