Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
Прочие статьи:
Развитие гипофиза (Hypophysis cerebri)
Как уже ранее, при описании развития первичной ротовой полости, ynоминалось вкратце, придаток мозга (hypophysis cerebri) имеет два отдельных зачатка. Один из них берет начало из эктодермы первичной ротовой полости (карман Ратке) и образуе ...
Эффекты страбизма (косоглазия)
Аномалии, описанные ранее, были вызваны зашиванием век или использованием прозрачных диффузоров, приводящих к потере предметного зрения. Исходя из данных о том, что у детей, страдающих косоглазием или страбизмом (cross-eyed, strabismus, s ...
Влияние освещенности, уровня и течения воды на белугу
Прозрачность воды зависит от содержания в толще воды неорганических и органических взвешенных частиц, а также мельчайших растительных и животных организмов. Чем больше в воде содержится взвешенных частиц и микроорганизмов, тем меньше ее п ...