Возможные ошибки и варианты методики

В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными.

Анализ, проведенный Льюисом, показал, что существует линейная зависимость частоты CMGT-трансфекции от дозы донорных хромосом. В большинстве последующих экспериментов исследователи старались ввести в клетку как можно больше хромосом. Однако на практике количество хромосом, которое можно получить, ограничено. Основное препятствие в использовании очень большого количества донорных клеток – это высокая вязкость суспензии хромосом, которая способствует их агглютинации. Вот почему мы добавляем не более 20 хромосом на одну реципиентную клетку. Помимо механического воздействия для получения препарата хромосом можно применять и химическую обработку, включая использование мягких детергентов, таких, как дигитонин.

Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия «шока», варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальций приводится в разд. 6.

При использовании метода CM.GT образуются реципиентные клетки, содержащие фрагменты донорных хромосом: в некоторых случаях они встраиваются в геном реципиента, иногда реплицируются самостоятельно. Невозможно выделить параметр, контролирующий размеры передаваемого фрагмента, и в большинстве экспериментов получаются клоны, содержащие донорный материал в широком диапазоне. Мы детально анализировали введенные фрагменты во всех случаях. В них наблюдались перестройки: это либо внутренние делеции, либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами.


Прочие статьи:

Размножение
Большинство представителей отряда моногамны, у некоторых видов пары образуются на всю жизнь, и участие в воспитании потомства принимают оба родителя. Однако у большинства видов гусеобразных пары образуются только на один сезон, причём сам ...

Формирование Солнечной системы. Возникновение Земли. Происхождение Солнечной системы
Солнечная система состоит из центрального небесного тела – звезды Солнца, 8 больших планет, обращающихся вокруг него, их спутников, множества малых планет – астероидов, многочисленных комет и межпланетной среды. Большие планеты располагаю ...

Условия и причины существования потенциала покоя.
Расчеты и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что все клетки организма в состоянии «оперативного» покоя характеризуются определенной степенью поляризации. Плазмолемма каждой клетки заряжена, и в покое на ее внутренней поверхно ...

Разделы