Возможные ошибки и варианты методики

В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными.

Анализ, проведенный Льюисом, показал, что существует линейная зависимость частоты CMGT-трансфекции от дозы донорных хромосом. В большинстве последующих экспериментов исследователи старались ввести в клетку как можно больше хромосом. Однако на практике количество хромосом, которое можно получить, ограничено. Основное препятствие в использовании очень большого количества донорных клеток – это высокая вязкость суспензии хромосом, которая способствует их агглютинации. Вот почему мы добавляем не более 20 хромосом на одну реципиентную клетку. Помимо механического воздействия для получения препарата хромосом можно применять и химическую обработку, включая использование мягких детергентов, таких, как дигитонин.

Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия «шока», варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальций приводится в разд. 6.

При использовании метода CM.GT образуются реципиентные клетки, содержащие фрагменты донорных хромосом: в некоторых случаях они встраиваются в геном реципиента, иногда реплицируются самостоятельно. Невозможно выделить параметр, контролирующий размеры передаваемого фрагмента, и в большинстве экспериментов получаются клоны, содержащие донорный материал в широком диапазоне. Мы детально анализировали введенные фрагменты во всех случаях. В них наблюдались перестройки: это либо внутренние делеции, либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами.


Прочие статьи:

Современные космологические модели вселенной
Классическая космология исходила из утверждений абсолютности и бесконечности пространства и времени, а также неизменности и вечности Вселенной. Вопрос об эволюции Вселенной в целом не ставился – теория стационарного состояния Вселенной. ...

Цитогенетический метод
Цитогенетический метод основан на исследовании фотокариограммы – фотографии полного набора хромосом 1. Подсчет общего числа хромосом для определения видовой принадлежности. 2. Разбивка хромосом на пары. Используется правило индивидуальн ...

Экологические системы и их структура
К экологическим системам обычно относят все живые системы вместе с окружающей средой, начиная от отдельной популяции и кончая биосферой. Все они являются открытыми системами, которые обмениваются с окружающей природной средой веществом, э ...

Разделы