Возможные ошибки и варианты методики

В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными.

Анализ, проведенный Льюисом, показал, что существует линейная зависимость частоты CMGT-трансфекции от дозы донорных хромосом. В большинстве последующих экспериментов исследователи старались ввести в клетку как можно больше хромосом. Однако на практике количество хромосом, которое можно получить, ограничено. Основное препятствие в использовании очень большого количества донорных клеток – это высокая вязкость суспензии хромосом, которая способствует их агглютинации. Вот почему мы добавляем не более 20 хромосом на одну реципиентную клетку. Помимо механического воздействия для получения препарата хромосом можно применять и химическую обработку, включая использование мягких детергентов, таких, как дигитонин.

Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия «шока», варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальций приводится в разд. 6.

При использовании метода CM.GT образуются реципиентные клетки, содержащие фрагменты донорных хромосом: в некоторых случаях они встраиваются в геном реципиента, иногда реплицируются самостоятельно. Невозможно выделить параметр, контролирующий размеры передаваемого фрагмента, и в большинстве экспериментов получаются клоны, содержащие донорный материал в широком диапазоне. Мы детально анализировали введенные фрагменты во всех случаях. В них наблюдались перестройки: это либо внутренние делеции, либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами.


Прочие статьи:

Термодинамический анализ основной реакции. Исходные данные
Уравнение реакции: С2Н5ОН + О2 СН3СООН + Н2О Температурный интервал 10 ÷ 60ºC (283 ÷ 333 К) Шаг изменения температуры 10ºC Таблица 5. Исходные данные В-во ni , кДж/моль , Дж/(моль*К) А0 А1 ...

Пространство, время. Принципы относительности. Принципы симметрии. Законы сохранения
Уравнения Максвелла. В 1873 году Джеймс Максвелл опубликовал первый трактат, в котором впервые систематизировал все фундаментальные уравнения по электричеству и магнетизму. Но он был чистым теоретиком, и никогда не участвовал в экспериме ...

Семейство дельфиновые (Dеlрнinidае)
Дельфиновые — мелкие (1 — 10 м), преимущественно очень подвижные морские китообразные стройного сложения. У большинства дельфиновых имеется спинной плавник, расположенный близ середины тела. У хвостового плавника на заднем крае глубокая в ...

Разделы