Методика используется при исследовании всех вариантов волос, в том числе и волоса, не имеющего луковичной части. При отсутствии луковичной части волоса исследуют прикорневую часть стержня волоса длиной не менее 3 см и не более 10 см. Последовательность выполнения методики:
1. Волос микроскопируют и отмывают (как описано выше).
2. Волос режут на кусочки длиной около 1 см и помещают в пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл).
3. В пробирку с волосом добавляют 500 мкл буфера I, 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 6 ч. В процессе выдерживания волос частично растворяется.
4. Пробирку помещают на вортекс (прибор для встряхивания) и встряхивают 30 с при средней скорости.
5. Затем к раствору в пробирке добавляют 20 мкл 1 М ДТТ и 15 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы К. Пробирку помещают в термостат и выдерживают при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь), после чего волос полностью растворяется.
6. Пробирку вновь помещают на вортекс и встряхивают 30 с при средней скорости, затем центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. После центрифугирования продукты лизиса волоса переходят в супернатант.
7. Супернатант отбирают в чистую пробирку "Эппендорф", добавляют 600 мкл смеси фенол-хлороформ, закрывают крышкой, помещают на вортекс и перемешивают 15 с на средней скорости, а затем центрифугируют 3 - 5 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Наблюдают разделение на две фазы: верхняя водная фаза содержит выделяемую ДНК, нижняя – фенол-хлороформ.
8. Верхнюю водную фазу переносят в чистую пробирку "Эппендорф" (V = 1,5 мл) и добавляют 500 мкл водонасыщенного н-бутанола с целью удаления остатка фенол-хлороформа, который может повредить мембрану "Центрикона-100". Помещают на вортекс, встряхивают 15 с на средней скорости и центрифугируют 1 мин при 10 000 - 15 000 об/мин при комнатной температуре. Водная фаза собирается на дне пробирки, верхний слой – удаляют.
9. "Центрикон-100" собирают по соответствующей инструкции и согласно рис. 3.
10. Нижнюю водную фазу, содержащую экстракт ДНК, фильтруют и концентрируют на "Центриконе-100", фильтрующем примеси с молекулярным весом более 100 000 дальтон. При данной фильтрации меланин волос и его производные, как более низкомолекулярные, проходят через мембрану "Центрикона-100".
11. Добавляют 1,5 мл ТЕ-буфера в верхний резервуар колонки "Центрикона-100". Сверху добавляют около 500 мкл экстракта ДНК. Пробирку закрывают парафильмом и, не касаясь раствора, прокалывают парафильм в нескольких местах тонкой чистой иглой. Центрифугируют на центрифуге с фиксированным углом ротора. Необходимо пересчитать скорость центрифугирования для используемой центрифуги в об/мин так, чтобы она составляла 1000g. Ниже приведена формула пересчета. Нельзя центрифугировать со скоростью более 1000g, во избежание повреждения мембраны "Центрикона-100". Время центрифугирования подбирают опытным путем так, чтобы ДНК сконцентрировалась в объеме 4 - 6 мкл, обычно не более 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования удаляют содержимое нижнего резервуара.
12. В верхний резервуар колонки "Центрикона-100", где концентрируется раствор ДНК в объеме 4 - 6 мкл, добавляют 2 мл ТЕ-буфера и повторяют фильтрацию 2 раза (закрыть парафильмом, проколоть его иглой, центрифугировать со скоростью 1000 g при комнатной температуре до объема 4 - 6 мкл ~20 мин, удалить содержимое нижнего резервуара, добавить 2 мл ТЕ-буфера и т. д.).
13. Профильтровав раствор ДНК 3 раза через мембрану "Центрикона-100", очистив его таким образом от примесей с молекулярным весом ниже 100 000 дальтон и сконцентрировав ДНК в заданном объеме (4 - 6 мкл), переносят раствор ДНК из верхнего резервуара в колпачок "Центрикона-100", который присоединяют к колонке верхнего резервуара и переворачивают. Центрифугируют 5 мин со скоростью 1000g при комнатной температуре. Все операции по фильтрации ДНК проводят с соблюдением максимально возможной чистоты и стерильности.
Прочие статьи:
Микроскопические структуры на молекулярной основе
На примере миксомицетов мы увидели, что сообщение между отдельными клетками на расстоянии может осуществляться благодаря диффузии химических веществ. Модели же для объяснения процесса дифференцирования клеток были предложены математиками ...
Биологический возраст
При описании основных морфологических особенностей человека в различные возрастные периоды используют, как правило, средние показатели. Однако индивидуальные различия в процессах роста и развития могут варьировать в широких пределах. Особ ...
Предпосылки эволюционной идеи
Жизнь на Земле… Богатство ее форм поразительно! Всегда ли формы жизни были такими, какими мы их наблюдаем сегодня, или в течение многих тысячелетий они прошли длинный путь развития? С древних времен люди по-разному отвечали на этот вопрос ...