14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.
Для проведения ПЦР берут 4 - 6 мкл супернатанта при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.
Формула пересчета скорости вращения ротора центрифуги при использовании "Центрикона-100":
g = 118 × 10-7 × n2 × r;
где g - центрифужное поле (g=1000);
r - радиус, см (расстояние от центра ротора до оси вращения колонки фильтра, измеряется эмпирически для используемой центрифуги);
n - скорость вращения ротора, об/мин (задается на центрифуге).
Приготовление растворов для выделения ДНК из стержня волоса
Ниже приводятся прописи шести растворов, которые готовят предварительно и затем используют при составлении смесей растворов, необходимых для данного метода. При приготовлении растворов используют деионизированную воду.
Раствор № 1.
1 М раствор трис-HCl, pH 7,5 (1 л):
растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести pH раствора до 7,5 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл), добавить воду до объема 1 л.
Раствор № 2.
0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 (1 л):
растворить 186,1 г двузамещенной соли ЭДТА´2Н2О в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 едким натром (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет 8,0), добавить воду до объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.
Раствор № 3.
5 М раствор NaCl (1 л):
растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды и довести объем раствора до 1 л. Разлить по 100 мл.
Раствор № 4.
20% раствор натрия додецилсульфата SDS (100 мл):
растворить 20 г SDS в 80 мл воды при 60 °С, довести объем раствора до 100 мл.
Раствор № 5.
1 М раствор ацетата Na, рН 5,2 (100 мл):
растворить 13,6 г CH COONa´3H2O в 80 мл воды, довести рН раствора до 5,2 уксусной кислотой (примерно 2 мл), добавить воду до объема 100 мл.
Раствор № 6.
1 М раствор трис-НСl (1 л):
растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 45 мл), добавить воду до объема 1 л.
С помощью растворов № 1 - 6 готовят следующие смеси, используемые в методике:
Буфер 1.
10 мМ трис-НСl, рН 7,5;
10 мМ ЭДТА;
50 мМ NaCl;
2% SDS.
Смешать 1 мл 1 М трис-НСl (рН 7,5), 2 мл 0,5 М ЭДТА, 1 мл 5 М NaCl, 10 мл 20% SDS и 86 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.
1 М ДТТ.
Растворить 770 мг детиотреитола в 5 мл воды и добавить 50 мкл 1 М ацетата натрия. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.
10 мг/мл протеиназа К.
Растворить 10 мг протеиназы К в 10 мл воды. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.
Фенол-хлороформ.
Смешать10 частей фенола, насыщенного 1 М трис-НСl (рН 7,5), с 9 частями хлороформа. Хранить при температуре 4 °С не более двух месяцев, в темной емкости.
н-Бутанол.
Добавить 100 мл воды к 100 мл н-бутанола, перемешать. Бутанол находится в верхней фазе. Хранить при температуре 4 °С.
ТЕ-Буфер.
10 мМ трис-НСl, рН 8,0;
0,1 мМ ЭДТА.
Смешать 10 мл 1 М трис-НСl (рН 8,0) с 200 мкл 0,5 М ЭДТА и 990 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.
Прочие статьи:
Особенности строения
Эволюция птиц шла по единому пути, связанному с освоением воздушной среды. Полет как основной способ их передвижения наложил отпечаток на их внешнее и внутреннее строение (хотя сохранили также способность передвигаться по деревьям, по зе ...
Основные закономерности развития биосферы
Для уяснения специфики биосферы как саморазвивающейся системы необходимо прежде всего рассмотреть основные ее компоненты15, показать, что они — результат прогрессивной дифференциации вещества в ходе саморазвития биосферы, наконец, что вза ...
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий и определение их производственной
ценности
Для поддержания заквасок в наиболее активном состоянии необходимо постоянно производить замену заквасочных штаммов, что связано с изменением биологических свойств заквасочных микроорганизмов при их длительном культивировании и хранении.
...