Методика выделения ДНК из стержня волоса
Страница 2

Статьи » Исследование ДНК волос для идентификации личности » Методика выделения ДНК из стержня волоса

14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.

Для проведения ПЦР берут 4 - 6 мкл супернатанта при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.

Формула пересчета скорости вращения ротора центрифуги при использовании "Центрикона-100":

g = 118 × 10-7 × n2 × r;

где g - центрифужное поле (g=1000);

r - радиус, см (расстояние от центра ротора до оси вращения колонки фильтра, измеряется эмпирически для используемой центрифуги);

n - скорость вращения ротора, об/мин (задается на центрифуге).

Приготовление растворов для выделения ДНК из стержня волоса

Ниже приводятся прописи шести растворов, которые готовят предварительно и затем используют при составлении смесей растворов, необходимых для данного метода. При приготовлении растворов используют деионизированную воду.

Раствор № 1.

1 М раствор трис-HCl, pH 7,5 (1 л):

растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести pH раствора до 7,5 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл), добавить воду до объема 1 л.

Раствор № 2.

0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 (1 л):

растворить 186,1 г двузамещенной соли ЭДТА´2Н2О в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 едким натром (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет 8,0), добавить воду до объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.

Раствор № 3.

5 М раствор NaCl (1 л):

растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды и довести объем раствора до 1 л. Разлить по 100 мл.

Раствор № 4.

20% раствор натрия додецилсульфата SDS (100 мл):

растворить 20 г SDS в 80 мл воды при 60 °С, довести объем раствора до 100 мл.

Раствор № 5.

1 М раствор ацетата Na, рН 5,2 (100 мл):

растворить 13,6 г CH COONa´3H2O в 80 мл воды, довести рН раствора до 5,2 уксусной кислотой (примерно 2 мл), добавить воду до объема 100 мл.

Раствор № 6.

1 М раствор трис-НСl (1 л):

растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 45 мл), добавить воду до объема 1 л.

С помощью растворов № 1 - 6 готовят следующие смеси, используемые в методике:

Буфер 1.

10 мМ трис-НСl, рН 7,5;

10 мМ ЭДТА;

50 мМ NaCl;

2% SDS.

Смешать 1 мл 1 М трис-НСl (рН 7,5), 2 мл 0,5 М ЭДТА, 1 мл 5 М NaCl, 10 мл 20% SDS и 86 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.

1 М ДТТ.

Растворить 770 мг детиотреитола в 5 мл воды и добавить 50 мкл 1 М ацетата натрия. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.

10 мг/мл протеиназа К.

Растворить 10 мг протеиназы К в 10 мл воды. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.

Фенол-хлороформ.

Смешать10 частей фенола, насыщенного 1 М трис-НСl (рН 7,5), с 9 частями хлороформа. Хранить при температуре 4 °С не более двух месяцев, в темной емкости.

н-Бутанол.

Добавить 100 мл воды к 100 мл н-бутанола, перемешать. Бутанол находится в верхней фазе. Хранить при температуре 4 °С.

ТЕ-Буфер.

10 мМ трис-НСl, рН 8,0;

0,1 мМ ЭДТА.

Смешать 10 мл 1 М трис-НСl (рН 8,0) с 200 мкл 0,5 М ЭДТА и 990 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.

Страницы: 1 2 


Прочие статьи:

На какие особенности строения пластинчатой и грубоволокнистой костной ткани указывают их названия? Охарактеризуйте строение и функции остеона как структурной и функциональной единицы пластинчатой ко
Костная ткань представляет собой одну из разновидностей тканей внутренней среды организма. Она состоит из клеток и межклеточного вещества, в котором содержится большая часть неорганических соединений. Основная масса неорганических соедине ...

Приложения
Приложение 1 Строение касатки. Приложение 2 Эхолокация Охота на Тюлений Приложение 3 Строение зуба касатки ...

Мышление с точки зрения искусственного интеллекта
Некий прорыв совершили специалисты в области искусственного интеллекта, изучавшие в целях моделирования или имитирования как физический уровень мышления, так и уровни прикладной и здравого смысла. К сожалению, прорыв произошел не столько ...

Разделы