14. В колпачке "Центрикона-100" собирается выделенная ДНК, готовая к проведению ПЦР. Образец можно хранить при температуре –20 °С.
Для проведения ПЦР берут 4 - 6 мкл супернатанта при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.
Формула пересчета скорости вращения ротора центрифуги при использовании "Центрикона-100":
g = 118 × 10-7 × n2 × r;
где g - центрифужное поле (g=1000);
r - радиус, см (расстояние от центра ротора до оси вращения колонки фильтра, измеряется эмпирически для используемой центрифуги);
n - скорость вращения ротора, об/мин (задается на центрифуге).
Приготовление растворов для выделения ДНК из стержня волоса
Ниже приводятся прописи шести растворов, которые готовят предварительно и затем используют при составлении смесей растворов, необходимых для данного метода. При приготовлении растворов используют деионизированную воду.
Раствор № 1.
1 М раствор трис-HCl, pH 7,5 (1 л):
растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести pH раствора до 7,5 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл), добавить воду до объема 1 л.
Раствор № 2.
0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 (1 л):
растворить 186,1 г двузамещенной соли ЭДТА´2Н2О в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 едким натром (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока рН раствора не будет 8,0), добавить воду до объема 1 л. Хранить при комнатной температуре.
Раствор № 3.
5 М раствор NaCl (1 л):
растворить 292,2 г NaCl в 800 мл воды и довести объем раствора до 1 л. Разлить по 100 мл.
Раствор № 4.
20% раствор натрия додецилсульфата SDS (100 мл):
растворить 20 г SDS в 80 мл воды при 60 °С, довести объем раствора до 100 мл.
Раствор № 5.
1 М раствор ацетата Na, рН 5,2 (100 мл):
растворить 13,6 г CH COONa´3H2O в 80 мл воды, довести рН раствора до 5,2 уксусной кислотой (примерно 2 мл), добавить воду до объема 100 мл.
Раствор № 6.
1 М раствор трис-НСl (1 л):
растворить 121,1 г трис-HCl в 800 мл воды, довести рН раствора до 8,0 концентрированной соляной кислотой (приблизительно 45 мл), добавить воду до объема 1 л.
С помощью растворов № 1 - 6 готовят следующие смеси, используемые в методике:
Буфер 1.
10 мМ трис-НСl, рН 7,5;
10 мМ ЭДТА;
50 мМ NaCl;
2% SDS.
Смешать 1 мл 1 М трис-НСl (рН 7,5), 2 мл 0,5 М ЭДТА, 1 мл 5 М NaCl, 10 мл 20% SDS и 86 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.
1 М ДТТ.
Растворить 770 мг детиотреитола в 5 мл воды и добавить 50 мкл 1 М ацетата натрия. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.
10 мг/мл протеиназа К.
Растворить 10 мг протеиназы К в 10 мл воды. Хранить в аликвотах не более 200 мкл при температуре –20 °С.
Фенол-хлороформ.
Смешать10 частей фенола, насыщенного 1 М трис-НСl (рН 7,5), с 9 частями хлороформа. Хранить при температуре 4 °С не более двух месяцев, в темной емкости.
н-Бутанол.
Добавить 100 мл воды к 100 мл н-бутанола, перемешать. Бутанол находится в верхней фазе. Хранить при температуре 4 °С.
ТЕ-Буфер.
10 мМ трис-НСl, рН 8,0;
0,1 мМ ЭДТА.
Смешать 10 мл 1 М трис-НСl (рН 8,0) с 200 мкл 0,5 М ЭДТА и 990 мл воды. Хранить при температуре 4 °С.
Прочие статьи:
Научная революция в естествознании начала XX в.
Развитие электронной теории.
Идея атомарного строения электричества вытекала из законов электролиза Фарадея, на что в свое время обратил внимание и сам Фарадей, указывая, что "атомы тел, эквивалентные друг другу в отношении их обычн ...
Роль птиц в природе и их значение в жизни человека
Ни одна птица не может быть абсолютно вредной или полезной. Они также, как и другие животные, могут быть вредными или полезными в определенных обстоятельствах и в определенное время. Например, грачи летом питаются насекомыми и их личинкам ...
Биотехнология сельскохозяйственных растений. Перспективы
Начиная с каменного века люди отбирали растения с удовлетворяющими их характеристиками и сохраняли их семена на следующий год. Отбирая лучшие семена, первые агрономы осуществили первичное генетическое модифицирование растений и таким обра ...