Полимеразная цепная реакция — это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР: высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных патогенов.
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК; процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы. протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК.
В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n, где п — число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. Недавние эксперименты показали, что процесс амплификации идет гораздо более эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermits aquaticus. В отличие от термолабильного фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I Е. coli, использовавшегося ранее, Год-полимераза сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, и нет необходимости в замене фермента после каждого цикла. Еще одно достоинство новой полимеразы заключается в более высоком температурном оптимуме детерминируемой ею реакции, что значительно повышает специфичность, количественный выход и возможную длину синтезированных копий интересующей последовательности.
Эта работа описывает ПЦР-амплификацию с использованием ДНК-полимеразы Taq и стратегию прямого секвенирования продуктов ПЦР-амплификации.
Прочие статьи:
Действия при пожаре
Любой пожар начинается с загорания, которое нередко может ликвидировать один человек. Но ликвидировать пожар одному человеку практически невозможно. Разгулявшаяся стихия потребует значительных усилий большого числа людей, специальной пожа ...
Ушастая сова (Asio otus)
Статус: обычный, широко распространенный вид, самый многочисленный в Беларуси [40].
В наших исследованиях этот вид доминирует в отношении занимания искусственных гнездовий. За 4 года исследований отмечено 42 случая заселения гнездовий. У ...
Характеристика ядовитых бесхвостых
Из бесхвостых земноводных обилием ядовитых желез в коже отличаются жабы и жерлянки. Кожа этих амфибий сильно бугорчатая, как часто говорят, «бородавчатая». Отсюда и возникло суеверие, будто от жабы могут появиться на руках бородавки. На с ...