Полимеразная цепная реакция — это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР: высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных патогенов.
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК; процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы. протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК.
В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n, где п — число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. Недавние эксперименты показали, что процесс амплификации идет гораздо более эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermits aquaticus. В отличие от термолабильного фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I Е. coli, использовавшегося ранее, Год-полимераза сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, и нет необходимости в замене фермента после каждого цикла. Еще одно достоинство новой полимеразы заключается в более высоком температурном оптимуме детерминируемой ею реакции, что значительно повышает специфичность, количественный выход и возможную длину синтезированных копий интересующей последовательности.
Эта работа описывает ПЦР-амплификацию с использованием ДНК-полимеразы Taq и стратегию прямого секвенирования продуктов ПЦР-амплификации.
Прочие статьи:
Хищные грибы к вашим услугам
Вам когда-либо попадался в лесу зубастый подберезовик? А вооруженного острыми когтями масленка не видали?
Нет? Тогда все правильно. Лесные грибы - народ мирный. Даже пользующийся недоброй славой красавец мухомор ни на кого нападать не со ...
Открытие клетки
Изучение мельчайших структур живых организмов стало возможным лишь после изобретения микроскопа, т.е. после 1600. Первое описание и изображения клеток дал в 1665 английский ботаник Р.Гук: рассматривая тонкие срезы высушенной пробки, он об ...
Тип плоские черви
Плоские черви живут в пресных и морских водоемах, во влажной подстилке тропических лесов, ведут паразитический образ жизни. Для них характерно плоское двусторонне-симметричное листовидное или лентовидное тело. У них имеются покровная, мыш ...