Введение

Полимеразная цепная реакция — это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР: высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных патогенов.

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК; процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы. протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК.

В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n, где п — число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. Недавние эксперименты показали, что процесс амплификации идет гораздо более эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermits aquaticus. В отличие от термолабильного фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I Е. coli, использовавшегося ранее, Год-полимераза сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, и нет необходимости в замене фермента после каждого цикла. Еще одно достоинство новой полимеразы заключается в более высоком температурном оптимуме детерминируемой ею реакции, что значительно повышает специфичность, количественный выход и возможную длину синтезированных копий интересующей последовательности.

Эта работа описывает ПЦР-амплификацию с использованием ДНК-полимеразы Taq и стратегию прямого секвенирования продуктов ПЦР-амплификации.


Прочие статьи:

Фотография и «золотое сечение»
Производя съемку, фотохудожник каждый раз решает непростую задачу -добиться реалистичного изображения трехмерного пространства на плоской поверхности. В этом ему помогает не только совершенная фотографическая техника, но и знание приемов ...

Появление человека
С появлением человека разумного начался новый этап эволюционно-революционного развития природы, направленного на усложнение материального мира. Отличаясь от животных развитым сознанием, мышлением и речью, сформировавшимися в результате ко ...

Выводы
Частота хронического панкреатита в общей популяции колеблется от 0,16 до 2,8% . Клиническое разнообразие панкреатита зависит от степени выраженности панкреатической недостаточности, давности заболевания, частоты рецидивов и объема повреж ...

Разделы