Методы количественного и качественного определения и исследования

Статьи » ДНК. Основы генетического материала » Методы количественного и качественного определения и исследования

Большинством цветных химических реакций ДНК обязаны своему углеводному компоненту — дезоксирибозе. Под действием кислот ДНК легко отщепляет пуриновые основания, причем освобождается альдегидная группа дезоксирибозы. В результате дальнейшего действия кислоты дезоксирибоза претерпевает превращения с образованием w-оксилевулинового альдегида: ответственного, по-видимому, за образование окраски с реактивами на ДНК.

Чаще других реакций для обнаружения и количественного определения ДНК применяют нагревание с дифениламином в концентрированной уксусной кислоте в присутствии концентрированной серной кислоты. Эту реакцию обычно применяют в модификации Бертона (К. Burton) при 30° в присутствии уксусного альдегида. Реже применяются менее чувствительные цветные реакции с цистеином, с триптофаном или индолом, а также с карбазолом. Иногда применяют также цветную реакцию с ганитрофенилгидразином. Весьма чувствительным является флюориметрический метод, позволяющий определять до 3.10-9 г ДНК.

Для количественного определения ДНК необходимо ее предварительное отделение от РНК и (по возможности) от других веществ, мешающих применяемой реакции. Для этих целей обычно пользуются методом Шмидта и Таннгаузера (G. Schmidt, S. J. Thannhauser) в различных модификациях. Принцип метода заключается в осаждении нуклеиновых кислот вместе с белками трихлоруксусной или хлорной кислотой, отмывании кислоторастворимых фосфорных соединений, экстрагировании липидов и извлечении нуклеиновых кислот при помощи гидролиза 5% трихлоруксусной кислотой при 90° в течение 15—20 мин. Белки при этом остаются в осадке; из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты и подвергнутого гидролизу 0,3— 1,0 н. щелочью, вызывающей распад РНК до нуклеотидов, ДНК осаждают подкислением трихлоруксусной или хлорной кислотой. Осадок отмывают и ДНК экстрагируют горячей хлорной кислотой. Содержание ДНК определяют по фосфору, спектрофотометрически или при помощи специфических цветных реакций, но спекислотрофотометрический метод является наиболее простым и быстрым для определения ДНК после отделения ее от других веществ, характеризующихся максимумом поглощения при 260 нм.

При определении нуклеотидного состава ДНК последнюю подвергают гидролизу хлорной кислотой и отщепившиеся пуриновые и пиримидиновые основания разделяют хроматографией на бумаге или на ионообменниках. Хорошие результаты дает также хроматография в тонком слое на производных целлюлозы и др. Поскольку в обычных двуспиральных ДНК нуклеотидный состав подчиняется определенным правилам (правила Чаргаффа), он может быть выражен в виде процентного содержания ГЦ-пар. Молярный процент ГЦ-пар вычисляют, используя температуру плавления ДНК (температура, при которой денатурирована половина ДНК), по формуле: процент ГЦ-пар = 2,44 ((°пл — 69,3°). Коэффициенты, приведенные в формуле, рассчитаны эмпирически и варьируют в зависимости от ионной силы, ионного состава и величины рН раствора. Хорошие результаты при определении нуклеотидного состава ДНК дает метод улътрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Плавучая плотность ДНК при этом линейна связана с молярным содержанием ГЦ-пар (изменение содержания ГЦ-пар на 1% изменяет плавучую плотность на 0,001 единицы) и определяется по уравнению: молярное содержание ГЦ-пар = 10,2 .(р — 1,660), где р — плавучая плотность исследуемого препарата ДНК. Для чистых препаратов ДНК нуклеотидный состав можно определить также по спектру поглощения в 0,1 М уксусной кислоте по формуле, предложенной Фредериком (Е. Fredericq).


Прочие статьи:

Выбор фермента рестрикции
Обсуждаемые молекулярные основы вариабельности членов семейств ГВР заключаются в разном количестве повторяющихся единиц в каждом ГВР-локусе. Чтобы выявить вариации подобного рода с возможно большим разрешением, необходимо гидролизовать ДН ...

Человек
В результате хозяйственной деятельности человека — вырубки лесов, распашки целинных степей, осушение болот — численность многих видов бабочек значительно сократилась, а некоторые из них находятся на грани вымирания. Бабочки являются наибо ...

Тип кольчатые черви
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЬЧАТЫХ ЧЕРВЕЙ Кольчатые черви живут в морях, пресных водоемах, почве. У них длинное тело, поделенное поперечными перетяжками на кольцевидные членики (сегменты). Наружному расчленению соответствует внутренняя сегме ...

Разделы