Результаты и обсуждение.
Страница 2

Модификация метода получения метиловых эфиров дансил-аминокислот заключалась в прямой обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, дансилхлоридом и диазометаном. В результате применения этого подхода удалось получить чётко интерпретируемые масс-спектры электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот в присутствии следовых количеств низкомолекулярных метаболитов среды и сопутствующих аминокислот не прибегая к их предварительному хроматографического разделению и очистке. Следует отметить, что в условиях проведения дансильной дериватизации, для основной аминокислоты лизина характерно образование ди-дансильных производных, а для тирозина также происходит дополнительное дансилирование по гидроксильной -ОН-группе. При этерификации аминокислот диазометаном не исключено дополнительное N-метилирование по а-NH2-группе аминокислот, что приводит к появлению в масс-спектре метиловых эфиров дансил-аминокислот пиков, соответствующих соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных [14]. В качестве примера на рис. 2,б приведен масс-спектр секретируемого фенилаланина и сопутствующих аминокислот в составе дериватизированной культуральной жидкости в условиях эксперимента 5 (см. табл.1, опыт 5), где концентрация D2О в среде достигает 49 об.% (спектр приведен относительно контрольных условий (а), где использовали обычную воду и метанол). Из рис.2,б видно, что в этих условиях величина пика молекулярного иона производного фенилаланина (М+. с m/z 414,2) увеличивается по сравнению с контрольными условиями (М+. с m/z 412,0) на 2,2 единицы, что составляет 27,5 % от общего количества атомов водорода в молекуле. Пик с m/z 400, зафиксированный в масс-спектре культуральной жидкости (рис.2,б) вероятнее всего соответствует продукту отщепления метильной группы -СН3 от дейтерированного производного фенилаланина.

Масс-спектр культуральной жидкости, полученной на среде, содержащей 73,5 об.% D2О и 2 об. % СН3ОН после обработки дансилхлоридом и диазометаном представлен на рис. 3,а. Присутствие в масс-спектре этого образца пика молекулярного иона метилового эфира дансил-фенилаланина с М+. с m/z 416,1 (вместо 412 в контроле) указывает на увеличение массы фенилаланина на 4,1 единицу, т.е., 51,2 % атомов в молекуле фенилаланина замещены на дейтерий (рис. 3,а). Необходимо подчеркнуть, что вышеобозначенные атомы дейтерия включаются в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы, так как маловероятно, что они заместились в в ходе выделения аминокислоты из культуральной жидкости или при химической модификации фенилаланина. Что касается протонов (дейтеронов) при гетероатомах в NH2-, NH-, и -COOH группах аминокислот, то они за счёт лёгкости диссоциации легко обмениваются на дейтерий даже при растворении аминокислот в D2O. Так как все этапы, связанные с обработкой культуральной жидкости, содержащей дейтерий и её химической модификации проводились с использованием немеченных компонентов, растворителей и в т.ч. водных растворов, то эти протоны(дейтероны) из-за лёгкости диссоциации труднее всего поддаются точному подсчёту и контролю. Это могло служить причиной небольшого расхождения результатов при подсчёте степеней дейтерированности аминокислот.

Во всех исследуемых образцах культуральной жидкости B. methylicum кроме основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин), обнаружены примеси (на уровне 3-5 мМ) метаболически связанных с ним аланина, валина и лейцина (изолейцина) (см., например рис 3,а). Как видно из рис.3,а, изотопный состав аланина характеризовался увеличением молекулярной массы на 2,5 единицы, валина-3,5 единицы, а лейцина (изолейцина)-4,6 единицами. Таким образом, в отличие от фенилаланина, количество включенного дейтерия в последних трех аминокислотах сохраняет стабильное постоянство в довольно широком интервале концентраций D2O в среде (от 49 об.% до 98 об.%).

Контроль за включением дейтерия в фенилаланин за счет ассимиляции дейтерометанола при росте бактерий на среде, содержащей обычную воду и 2% СD3OD (соответствуют опыту 2, табл.1) показал незначительное количество дейтерия, которое поступает в молекулу фенилаланина вместе с углеродом СD3OD. Процент дейтерирования фенилаланина был оценен по величине пика 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (не более 4 %, масс-спектр не приведён). Полученный результат может быть обусловлен разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания как биохимических процессов, связанных с распадом дейтеро-метанола при его усвоении клеткой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации. Например, из четырёх атомов дейтерия, имеющихся в молекуле СD3OD, лишь атом дейтерия при гидроксильной группе --OD самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием СD3OH. Три оставшихся атомов дейтерия в составе СD3OH входят в цикл ферментативного окисления метанола, который также мог привести к потере дейтерия за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. В частности, полученный результат по уровню включения дейтерия в фенилаланин подтверждает классическую схему ферментативного окисления метанола до формальдегида в клетках метилотрофов, который лишь после этого ассимилируется у данного штамма метилотрофных бактерий рибулозомонофосфатным путем фиксации углерода [15].

Страницы: 1 2 3


Прочие статьи:

Методы исследования
Муковисцидоз представляет собой системное мультиорганное заболевание наследственного характера, имеющее в своей основе поражение экзокринных желез организма. В настоящее время из более 250 описанных наследственных болезней обмена веществ ...

Роль растений в природных сообществах
В природе виды растений, животных, грибов и микроорганизмов распределяются не случайно. Они образуют природные сообщества. Члены природного сообщества связаны прямыми или косвенными пищевыми отношениями, создают среду обитания друг для др ...

Термостабильность макромолекул
Выделенные из термофильных организмов макромолекулы обнаруживают большую термостабильность, чем их аналоги из мезофилов. Такая повышенная термостабильность, свойственна всем макромолекулам клетки, включая ферменты главных метаболических п ...

Разделы