тестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК связана с полисомами.
Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента, что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.
Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизации и специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз. Эксперимент включает три этапа. На первом клонированный фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом и денатурируют. Можно также использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для образования ДНК-РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК, присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК с положением молекул ДНК известного размера.
Этот основной эксперимент можно проводить во многих разных вариантах, каждый из которых позволяет выявить свои особенности структуры РНК в зависимости от того, какая именно нуклеаза используется, является ли РНК суммарной или очищенной цитоплазматической ро1у-мРНК. Один из таких вариантов, где в ДНК имеется один протяженный участок, комплементарный РНК, и не спарены только концы молекулы. Метод позволяет также выявить любую область, где отсутствует комплементарность между РНК и ДНК. Во многих экспериментах такого рода используется специфичная к одноцепочечной ДНК эндонуклеаза S1, поэтому метод называют картированием.
81-картирование часто используют для установления соответствия между началом молекулы РНК и специфическим сайтом в клонированном сегменте ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет собой сайт инициации транскрипции. Точность эксперимента значительно повышается, если используется небольшой ДНК-зонд, что позволяет измерить длину защищенного сегмента ДНК с точностью до одного нуклеотида. Для получения такого зонда обычно субклонируют строго определенные участки длинного фрагмента ДНК. Размер защищенного фрагмента ДНК определяют с помощью электрофореза в таких же гелях, что и при определении нуклеотидной последовательности.
Удлинение праймера: исследование родства между внутриклеточной РНК и клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд, который гибридизуется с участком РНК, желательно находящимся на расстоянии не более 100 пар оснований от предполагаемого 5'-конца РНК. ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транскриптаза прекращает копирование, когда достигает 5'-конца РНК, размер продукта позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК, исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК.
б. Функциональное тестирование клонированной ДНК
Прочие статьи:
Огнёв Сергей Иванович
Огнёв Сергей Иванович (5.11.1886-20.12.1951) - советский зоолог, заслуженный деятель науки РСФСР (1947). Выдающийся зоолог-позвоночник, глава московской школы териологии в 1930–1940 гг. Происходит из семьи потомственной московской интелли ...
Инвестиции конским навозом. Наш опыт -- Америке
А
ссоциация грибоводов США идет курсом ударной пятилетки, обязавшись к 2010 году производство грибов удвоить. Программа поддержана правительственными субсидиями. Американцы решили перекрыть советские общепитовские рыбные дни и проводят це ...
Антигенная структура
Вас. anthracis изучена еще недостаточно.
Н.Ф. Гамалея (1928) установил, что в подкожном отеке, образующемся на месте введения возбудителя, содержатся ядовитые вещества, вызывающие при введении в кровь быструю гибель кролика. Watson, Bloo ...