Клонированные сегменты ДНК можно транскрибировать и транслировать в эукариотических системах либо in vitro с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo после введения клонированного сегмента в клетку.
Системы in vitro. Для приготовления бесклеточных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, II и III, обычно используют разнообразные эукариотические клетки. В анализируемом сегменте должны присутствовать последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции; необходимы также вспомогательные белки, стимулирующие транскрипцию. При фракционировании таких экстрактов получают очищенные или частично очищенные полимеразы и факторы, с помощью которых можно детально изучить механизмы транскрипции. Для осуществления трансляции мРНК с образованием соответствующих полипептидов используют другие типы клеточных экстрактов.
Системы in vivo. Для изучения функций клонированного сегмента ДНК лучше всего использовать целые клетки, поскольку это позволяет следить как за процессом транскрипции, так и за процессом трансляции. Наиболее изученной биологической тест-системой являются ооциты лягушки. Ооциты - это крупные клетки объемом до 1 мкл, которые можно многократно получать от одной лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро, при этом обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплексе с гистонами ооцита упаковывается с образованием хроматина, далее осуществляются ее транскрипция и трансляция, и в течение нескольких часов можно идентифицировать продукты экспрессии генов - мРНК и полипептиды. Для проведения эксперимента часто оказывается достаточно того количества РНК и полипептидов, которое синтезируется одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия инъецированных клонированных генов в ооцитах протекает нормально. Исходные ядерные транскрипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят в цитоплазму.
Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в большую популяцию клеток одновременно. При этом используется методика трансфекции в связи с клонированием в эукариотических клетках. По крайней мере часть молекул, введенных таким способом, достигает ядер.
Прочие статьи:
До человека
Человек. Человечество. Вселенная. Как связаны эти понятия? Какое место занимает человек во Вселенной? Чтобы ответить на эти и многие другие вопросы, прежде всего, рассмотрим эволюцию Вселенной с момента ее рождения до наших дней и загляне ...
Техника посадки зелёных черенков смородины
Черная смородина относится к культурам, зеленые черенки которых легко укореняются без каких-либо побочных на них воздействий. Однако многочисленными исследованиями было установлено, что обработка черенков регуляторами роста ускоряет и улу ...
Бинокулярная депривация и роль конкуренции
Первым доводом против того, что уменьшение зрительной активности может привести к изменениям в работе нейронов, являются данные эксперимента, когда у детеныша обезьяны, новорожденного или рожденного путем кесарева сечения, закрывали сразу ...