Клонированные сегменты ДНК можно транскрибировать и транслировать в эукариотических системах либо in vitro с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo после введения клонированного сегмента в клетку.
Системы in vitro. Для приготовления бесклеточных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, II и III, обычно используют разнообразные эукариотические клетки. В анализируемом сегменте должны присутствовать последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции; необходимы также вспомогательные белки, стимулирующие транскрипцию. При фракционировании таких экстрактов получают очищенные или частично очищенные полимеразы и факторы, с помощью которых можно детально изучить механизмы транскрипции. Для осуществления трансляции мРНК с образованием соответствующих полипептидов используют другие типы клеточных экстрактов.
Системы in vivo. Для изучения функций клонированного сегмента ДНК лучше всего использовать целые клетки, поскольку это позволяет следить как за процессом транскрипции, так и за процессом трансляции. Наиболее изученной биологической тест-системой являются ооциты лягушки. Ооциты - это крупные клетки объемом до 1 мкл, которые можно многократно получать от одной лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро, при этом обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплексе с гистонами ооцита упаковывается с образованием хроматина, далее осуществляются ее транскрипция и трансляция, и в течение нескольких часов можно идентифицировать продукты экспрессии генов - мРНК и полипептиды. Для проведения эксперимента часто оказывается достаточно того количества РНК и полипептидов, которое синтезируется одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия инъецированных клонированных генов в ооцитах протекает нормально. Исходные ядерные транскрипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят в цитоплазму.
Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в большую популяцию клеток одновременно. При этом используется методика трансфекции в связи с клонированием в эукариотических клетках. По крайней мере часть молекул, введенных таким способом, достигает ядер.
Прочие статьи:
Общая характеристика.
Первые голосеменные появились в конце девонского периода около 350 млн. лет назад; вероятно, они произошли от древних папоротниковидных, вымерших в начале каменноугольного периода. В мезозойскую эру — эпоху горообразования, поднятия матер ...
Выращивание растений при искусственном освещении. Условия наилучшего использования
электрического света.
Исследования показали, что на развитие растений в значительной мере влияет интенсивность и спектральный состав света. В связи с этим большой интерес представляют опыты В.И. Разумова, который доказал, что красный свет действует как естеств ...
Где синтезируются мембранные липиды?
Прокариоты
У Е. coli весь синтез фосфолипидов протекает в плазматической мембране. В общих чертах этот процесс представлен на рис. 10.16. Жирные кислоты синтезируются в виде предшественников, ковалеитно связанных с белком — переносчиком ...