Все эксперименты по переносу генетического материала состоят из двух отдельных этапов: переноса ДНК от донора к реципиенту и отбора реципиентных клеток, которые включили генетический материал донора. Большинство соответствующих методов позволяют ввести чужеродный материал в одну клетку из тысячи, а то и десяти миллионов, поэтому для отбора нужны весьма эффективные средства. Именно эта стадия зачастую является лимитирующей в ходе эксперимента.
Первые опыты по переносу генетического материала осуществляли с помощью слияния целых клеток. Такая техника нашла применение при изучении процессов дифференцировки и канцерогенеза, однако наиболее успешно ее использовали при картировании генов человека и получении моноклональных антител. Известно, что сформировавшийся при слиянии клеток грызуна и человека межвидовой гибрид спонтанно теряет человеческие хромосомы. Как правило, утрата хромосом происходит случайным образом, и это позволяет конструировать гибридные линии клеток, в которых содержатся разные хромосомы человека. Корреляция между присутствием конкретной хромосомы человека и экспрессией генетического маркера является основой для отнесения соответствующего гена к определенной группе сцепления. Из 1300 генов человека, картированных на сегодняшний день, примерно треть локализована на конкретных хромосомах с помощью методов генетики соматических клеток. Процесс утраты хромосом у внутривидовых гибридов происходит не так быстро, как у гибридов межвидовых. При слиянии клеток мышиной миеломы с клетками селезенки формируются стабильные линии гибридных клеток. Их характеризует иммортальность, унаследованная от миеломных клеток, и способность продуцировать антитела.
Хромосомная нестабильность межвидовых гибридов, сложности при кариотипировании тетраплоидных внутривидовых гибридов ограничивали применение методов генетики соматических клеток для генетического анализа сложных фенотипов. Необходимо было научиться переносить отдельные хромосомы между соматическими клетками. Это удалось сделать с помощью мини-клеток. Несмотря на технические трудности, метод MMGT с успехом использовали для создания гибридов и последующего картирования генов, для анализа процессов дифференцировки и развития опухоли. Такие эксперименты позволили с уверенностью говорить о существовании специфических ^rans-действующих регуляторов, участвующих в формировании фенотипа дифференцированной клетки; кроме того, был подтвержден рецессивный характер гена опухоли Вильмса.
Методы слияния целых клеток и MMGT эффективны для хромосомной локализации гена, возможность более тонкого картирования этими методами ограничена, так как оно требует наличия хромосом с транслокациями и делециями. Для решения этой задачи разработаны два метода: перенос генов, опосредованный хромосомой, и перенос генов в процессе слияния облученной клетки-донора с необлученным реципиентом. Первый способ предполагает инкубацию очищенных митотических хромосом с клетками-реципиентами в присутствии фосфата кальция. При этом происходит встраивание фрагментов донорных хромосом в хромосомы клетки-реципиента. Для идентификации гибридов, содержащих нужные фрагменты ДНК донора, применяют соответствующие методы селекции. К сожалению, встроенные фрагменты хромосом зачастую претерпевают реорганизацию, кроме того, есть достоверные данные о предпочтительном проникновении в клетку и последовательностей из центромерных областей. Эти недостатки не позволяют использовать CMGT для картирования, хотя данный метод весьма эффективен для обогащения специфическими фрагментами хромосом – составной части стратегии клонирования, называемой «обратной генетикой». Госс и Харис впервые показали, что фрагменты Х-хромосомы человека, появляющиеся в его гамма-облученной клетке, можно сохранить при слиянии этой клетки с клеткой грызуна. Углубленный анализ метода IFGT показал, что полученные фрагменты реорганизованы и для них характерна та же тенденция представлять центромерные области, что и при CMGT.
Прочие статьи:
Микроскопические структуры на молекулярной основе
На примере миксомицетов мы увидели, что сообщение между отдельными клетками на расстоянии может осуществляться благодаря диффузии химических веществ. Модели же для объяснения процесса дифференцирования клеток были предложены математиками ...
Ядовитые лягушки теряют свои токсины
Увы, разрушающее влияние человеческой деятельности на природу приобретает всё более разнообразные формы. В частности, Валери Кларк (Valerie C. Clark), студентка университета Корнелла (Cornell University), вместе с коллегами обнаружила, чт ...
Современные космологические модели вселенной
Классическая космология исходила из утверждений абсолютности и бесконечности пространства и времени, а также неизменности и вечности Вселенной.
Вопрос об эволюции Вселенной в целом не ставился – теория стационарного состояния Вселенной. ...