Полимеразная цепная реакция предусматривает инкубацию образцов при трех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации, - денатурации, отжигу и достройке.
Обычно двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева образца до 90-95°С, затем проводят отжиг, охлаждая образец до 40-60°С, и далее нагревают до 70-75°С, чтобы осуществить достройку отожженных затравок с помощью 7а-7-полимеразы. Время инкубации при 70-75 СС варьируют в зависимости от длины амплифицируемой последовательности. Длительность температурного скачка определяется типом оборудования, используемого для нагрева и охлаждения. За одним лишь исключением, скорость смены температуры не имеет значения и для сокращения длительности цикла практически всегда используются быстрые температурные скачки. Однако, чтобы быть уверенным, что образцы все-таки нагрелись до необходимой температуры, время скачка следует определить, проводя замеры температуры в контрольном эксперименте амплификации. Термопара для замера в микронробах и цифровой многофункциональный счетчик очень полезны для этих целей.
Обычно длительность смены температур для 100 мкл реакционной смеси в 1,5 мл пробирках и водяных банях, настроенных на 72°, 93о и 55°С, следующая:
1) 72° — 93°С— 1 мин,
2) 93 — 55°С— 1 мин,
3) 55 — 72°С — 45 с.
Время скачка для таких же образцов, но в нагревательном блоке с формованными отверстиями обычно больше, по крайней мере, в два раза. Недостаточный прогрев на этапе денатурации — одна из наиболее распространенных причин неудач при проведении реакции ПЦР вручную. Как правило, разделение цепей происходит, если реакционная смесь нагрета выше 90°С. Чтобы гарантировать разделение, следует довести температуру смеси до 93°С. Как только этот рубеж достигнут, образец можно охлаждать до температуры отжига затравки. Долгая денатурация не является необходимой; более того, именно непродолжительное воздействие повышенных температур обеспечивает поддержание высокой активности фермента в течение всей реакции амплификации. Чтобы предотвратить потерю влаги за счет испарения с поверхности реакционной смеси, можно наслоить на нее 50 мкл минерального масла.
Температура проведения отжига зависит от длины затравки и содержания в ней GC-nap. Для типичной затравки длиной 20 нуклеотидов и 50%-ным содержанием GC-nap подбор температуры хорошо начинать с 50-60°С. Из-за большого молярного избытка затравки в реакционной смеси гибридизация происходит почти мгновенно и не требуется долгой инкубации при температуре отжига. Иногда оказывается возможным отжигать затравки и при 72°С, т.е. при температуре достройки. При этом значительно упрощается вся процедура: она сводится к двухтемпературному циклу.
В некоторых случаях, когда доступны только 12-15-нуклеотидные затравки, требуется температура отжига 40°С. Однако затравки такой длины не удерживаются на матрице при температуре достройки 72°С. Преодолеть эту трудность можно следующим образом. Используя частичную ферментативную активность полимеразы при низких температурах, можно удлинить затравки на несколько нуклеотидов и тем самым стабилизировать их. Это достигается либо за счет промежуточной инкубации в течение нескольких минут при 55-60°С или путем медленного нагревания от 40 до 72°С.
Температура достройки праймера 72°С очень близка к температуре, при которой ДНК-полимераза Taq проявляет максимальную активность. Как уже отмечено, продолжительность инкубации при 72°С зависит от длины амплифицируемого участка ДНК. Считается, что Га-полимераза синтезирует последовательность длиной 1000 нуклеотидов за 1 мин, однако можно опробовать и более короткое время инкубации. Этап удлинения затравки можно совсем исключить, если исследуемая последовательность имеет длину, не превышающую 150 нуклеотидов. При нагреве между этапами отжига и денатурации образцы будут находиться в диапазоне температур 70-75°С несколько секунд, что достаточно для полной достройки отожженной затравки.
Прочие статьи:
Поведение
Наконец, наиболее старое латинское название, относящиеся к касатке, - это Delphinus orca, или "дельфин-касатка". Из-за полученной репутации опаснейшего убийцы касатка получила свое английское название killer whale ("кит-уби ...
Примеры энтропии
В первую очередь, я бы хотела рассмотреть самый простой пример, который касается всех нас. Это создание мира Богом. Как говорится в библии, Мир был как бездна, безводна, пуста и темна. Все в этом мире находилось в хаосе, то есть в увеличе ...
Клещи
Конец апреля – это время, когда начинается не только сезон пикников и дач, но и сезон активности клещей. Одно другому очень даже мешает. За клещевым энцефалитом совсем не обязательно ехать туда, где «зеленое море тайги».
КЛЕЩ сидит в в ...