Параметры температурных циклов

Статьи » Полимеразная цепная реакция » Параметры температурных циклов

Полимеразная цепная реакция предусматривает инкубацию образцов при трех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации, - денатурации, отжигу и достройке.

Обычно двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева образца до 90-95°С, затем проводят отжиг, охлаждая образец до 40-60°С, и далее нагревают до 70-75°С, чтобы осуществить достройку отожженных затравок с помощью 7а-7-полимеразы. Время инкубации при 70-75 СС варьируют в зависимости от длины амплифицируемой последовательности. Длительность температурного скачка определяется типом оборудования, используемого для нагрева и охлаждения. За одним лишь исключением, скорость смены температуры не имеет значения и для сокращения длительности цикла практически всегда используются быстрые температурные скачки. Однако, чтобы быть уверенным, что образцы все-таки нагрелись до необходимой температуры, время скачка следует определить, проводя замеры температуры в контрольном эксперименте амплификации. Термопара для замера в микронробах и цифровой многофункциональный счетчик очень полезны для этих целей.

Обычно длительность смены температур для 100 мкл реакционной смеси в 1,5 мл пробирках и водяных банях, настроенных на 72°, 93о и 55°С, следующая:

1) 72° — 93°С— 1 мин,

2) 93 — 55°С— 1 мин,

3) 55 — 72°С — 45 с.

Время скачка для таких же образцов, но в нагревательном блоке с формованными отверстиями обычно больше, по крайней мере, в два раза. Недостаточный прогрев на этапе денатурации — одна из наиболее распространенных причин неудач при проведении реакции ПЦР вручную. Как правило, разделение цепей происходит, если реакционная смесь нагрета выше 90°С. Чтобы гарантировать разделение, следует довести температуру смеси до 93°С. Как только этот рубеж достигнут, образец можно охлаждать до температуры отжига затравки. Долгая денатурация не является необходимой; более того, именно непродолжительное воздействие повышенных температур обеспечивает поддержание высокой активности фермента в течение всей реакции амплификации. Чтобы предотвратить потерю влаги за счет испарения с поверхности реакционной смеси, можно наслоить на нее 50 мкл минерального масла.

Температура проведения отжига зависит от длины затравки и содержания в ней GC-nap. Для типичной затравки длиной 20 нуклеотидов и 50%-ным содержанием GC-nap подбор температуры хорошо начинать с 50-60°С. Из-за большого молярного избытка затравки в реакционной смеси гибридизация происходит почти мгновенно и не требуется долгой инкубации при температуре отжига. Иногда оказывается возможным отжигать затравки и при 72°С, т.е. при температуре достройки. При этом значительно упрощается вся процедура: она сводится к двухтемпературному циклу.

В некоторых случаях, когда доступны только 12-15-нуклеотидные затравки, требуется температура отжига 40°С. Однако затравки такой длины не удерживаются на матрице при температуре достройки 72°С. Преодолеть эту трудность можно следующим образом. Используя частичную ферментативную активность полимеразы при низких температурах, можно удлинить затравки на несколько нуклеотидов и тем самым стабилизировать их. Это достигается либо за счет промежуточной инкубации в течение нескольких минут при 55-60°С или путем медленного нагревания от 40 до 72°С.

Температура достройки праймера 72°С очень близка к температуре, при которой ДНК-полимераза Taq проявляет максимальную активность. Как уже отмечено, продолжительность инкубации при 72°С зависит от длины амплифицируемого участка ДНК. Считается, что Га-полимераза синтезирует последовательность длиной 1000 нуклеотидов за 1 мин, однако можно опробовать и более короткое время инкубации. Этап удлинения затравки можно совсем исключить, если исследуемая последовательность имеет длину, не превышающую 150 нуклеотидов. При нагреве между этапами отжига и денатурации образцы будут находиться в диапазоне температур 70-75°С несколько секунд, что достаточно для полной достройки отожженной затравки.


Прочие статьи:

Основные положения учения Дарвина
После путешествия Дарвин в течение 20 лет упорно работал над созданием эволюционного учения и опубликовал его в труде "Происхождение видов путем естественного отбора, или Сохранение благоприятствуемых пород в борьбе за жизнь" (1 ...

Термостабильность макромолекул
Выделенные из термофильных организмов макромолекулы обнаруживают большую термостабильность, чем их аналоги из мезофилов. Такая повышенная термостабильность, свойственна всем макромолекулам клетки, включая ферменты главных метаболических п ...

Естественнонаучная и гуманитарная культура. Научный метод. Естественнонаучная и гуманитарная культуры
Культура – в широком смысле есть совокупность созданных человеком материальных и духовных ценностей, а также сама человеческая способность эти ценности производить и использовать. Соответственно различают культуру материальную и духовную ...

Разделы