Затруднения, связанные с реассоциацией цепей фрагмента, можно преодолеть, если приготовить одноцепочечные образцы ДНК путем разделения цепей в геле или синтезировать их в самой реакции ПЦР. Для разделения цепей фрагментов длиной не менее 500 п. н. могут быть с успехом использованы соответствующие агарозные гели. В случае более коротких фрагментов такой подход не эффективен. Однако недавно мы разработали метод, позволяющий синтезировать одноцепочечные ДНК в ходе реакции ПЦР.
Эта процедура предусматривает использование неэквивалентных количеств двух праймеров для амплификации, что позволяет синтезировать за первые 20-25 циклов двухцепочечную ДНК и за последующие 5-10 циклов в условиях недостатка одного из праймеров — одноцепочечную ДНК.
Рис. 4, А демонстрирует накопление дцДНК и оцДНК в ходе обычной амплификации геномной последовательности, использующей исходное соотношение затравок 50:0,5 пмоль в 100 мкл реакционной смеси. Как и ожидалось, количество дцДНК возрастает экспоненциально до момента практического исчезновения из реакционной смеси одного из праймеров, после чего количество этой ДНК нарастает очень медленно. Фракция оцДНК появляется, начиная с 25-го цикла, с момента, когда запас лимитирующей затравки почти полностью исчерпан. После короткой начальной стадии быстрого роста оцДНК накапливается линейно, чего следует ожидать в присутствии одного праймера.
Разные соотношения праймеров дадут в принципе сходную картину образования оцДНК. Различные неравные отношения 50:5, 50:0,5, 50:0,05 дают за 30 циклов полимеразной реакции количество оцДНК, превышающее количество синтезированной дцДНК. Как правило, соотношение 50:0,5 позволяет получить после 30 циклов ПЦР 1-5 пмоль оцДНК. Образованная оцДНК может быть затем секвенирована с использованием лимитирующего праймера ПЦР или внутреннего праймера по обычной схеме химической или энзиматической методики секвенирования. Синтезированные фрагменты будут иметь гомогенный 5'-конец и в различной степени усеченный 3'-конец вследствие преждевременной терминами синтеза. Однако при использовании некоторых секвенационных затравок только полная оцДНК. может служить образцом для секвенирования.
1. Проведите реакцию ПЦР по уже описанной методике, изменив только количества используемых праймеров на 50 пмоль и 0,5 пмоль в 100 мкл реакционной смеси. Проведите 30— 35 циклов реакции. Если необходимо секвенировать обе цепи, приготовьте также образец с обратным соотношением объема используемых затравок.
2. После завершения ПЦР смешайте 100 мкл реакционной смеси с 2 мл дистиллированной воды, заполните этой смесью микроконцентратор Centricon 30 и для удаления избытка dNTP и компонентов буфера отцентрнфугируйте при 5000 об/мин в роторе с фиксированным наклоном пробирок.
3. Высушите 10 из 40 мкл концентрата и растворите в 10 мкл секвенационного буфера, содержащего 1 пмоль секвенационного праймера.
4. Прогрейте смесь праймер — матрица при 65 °С в течение 2 мин, затем оставьте охлаждаться до 30 °С в течение 20 мин.
5. Добавьте 1 мкл 100 мМ DDT, 2 мкл смеси для включения метки, разведенной в соотношении 1/100, 0,5 мкл dATP, 10 мкКи/мкл, 2 мкл ДНК-полимеразы Т7.
6. Внесите 3,5 мкл приготовленной смеси в каждую из 4 пробирок, содержащих 2,5 мкл смеси дидезоксирибонуклеозидов, и инкубируйте 5 мин при 37°С.
Остановите реакцию добавлением 4 мкл 95%-ного формамида, 20 мм ЭДТА; прогрейте в течение 2 мин при 75°С и нанесите на секвенационный гель.
Прочие статьи:
Питание
Интенсивность питания азовского пузанка и состав пищи зависят от наличия и доступности тех или иных организмов в водоёме в определенный момент. На интенсивность роста молоди пузанка влияет обеспеченность её кормом. Активное питание происх ...
Вечный бой
Для борьбы с нематодами в теплицах почву пропаривают и вносят ядохимикат - какой-либо нематицид, например дазомет или гетерофос. Для розничной продажи населению у нас разрешен только один нематицид - тиазон 40 %. Его рекомендуют равном ...
Биологическое значение условных рефлексов
Условный раздражитель - заблаговременный, отдаленный предвестник пищи, хищника, непогоды. Безусловный оборонительный рефлекс возникает тогда, когда биологически значимый раздражитель уже подействовал - жертва находится в когтях хищника, л ...