Макроструктура клонированной вставки
Страница 2

г. Определение положения интересующего нас сегмента во вставке

Для определения положения сегментов в небольших рекомбинантных геномах используются те же подходы, что и при нахождении специфических сегментов в больших геномах до клонирования. После построения рестрикционной карты вставки установить точную локализацию нужного сегмента не составляет труда. Для этого нужен только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК - или РНК-зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования.

Овальбумин-это белок, состоящий из одной полипептидной цепи; он синтезируется в яйцеводе курицы после стимуляции стероидным гормоном эстрогеном и накапливается в яичном белке. У кур-несушек стимуляция гормоном происходит в естественных условиях, а у цыплят образование яйцевода и синтез овальбумина индуцируются при введении эстрогена. Гормон индуцирует транскрипцию гена овальбумина, в результате чего содержание овальбуминовой мРНК в клетке увеличивается практически от нуля до 50000 молекул через две-три недели и падает до 10 молекул на клетку после прекращения воздействия эстрогена. Яйцеводы кур-несушек представляют собой хороший источник овальбуминовой мРНК, поскольку она составляет в них около 50% суммарной мРНК. Очищенную мРНК используют затем для приготовления радиоактивного зонда, применяемого для идентификации клонированного гена овальбумина. Зондом может служить радиоактивно меченная одноцепочечная кДНК, синтезированная непосредственно на мРНК с помощью обратной транскиптазы, или клонированная дуплексная кДНК. С помощью таких зондов из популяции Х-векторов, содержащих вставки геномной ДНК курицы, полученные при ограниченном гидролизе эндонуклеазой EcoRI, были отобраны клонированные последовательности овальбуминового гена. Вставка, имела длину 6,8 т.п. н. Из нее образовались три EcoRI-фрагмента, при этом только фрагмент длиной 2,35 т.п. н. отжигался с овальбуминовым кДНК-зондом.

Положение искомой последовательности в клонированном сегменте можно определить также с помощью электронной микроскопии. Для этого зонд и рекомбинантную ДНК смешивают, денатурируют и отжигают, а затем готовят препарат для микроскопирования. Комплементарные участки зонда и исследуемой молекулы образуют дуплексы, которые на электронных микрофотографиях выглядят как относительно толстые нити, а некомплементарные участки остаются одноцепочечными и имеют вид более тонких нитей. Гетеродуплекс, образующийся между овальбуминовым рекомбинантом формируются при условиях, благоприятных для гибридизации типа РНК'ДНК, а не ДНК'ДНК. В сегменте ДНК размером 2,35 т.п. н., который гибридизовался с мРНК, в образовании двухцепочечной структуры участвовали только около 550 п. н. Таким образом, гетеродуплексный анализ гораздо более информативен, чем определение положения кодирующих последовательностей в клоне. Он показывает, что, хотя мРНК содержит около 1800 п. н., в клонированном сегменте ДНК представлено менее трети длины кодирующих последовательностей гена овальбумина. Кроме того, 550 п. н. в клонированной ДНК, комплементарные мРНК, не образуют одну непрерывную последовательность, а распределены по четырем участкам, разделенным одноцепочечными петлями, т.е. кодирующие последовательности геномной ДНК чередуются с некодирующими. Как описано в разд.8.5, такие промежуточные последовательности, или интроны, типичны для эукариотических генов.

Страницы: 1 2 


Прочие статьи:

Циклы развития паразитов
Сохранению паразитов способствует не только усиление их воспроизводительной способности, но и усложнение цикла развития, в частности переход от прямого развития к сложному с участием одного или нескольких промежуточных хозяев, иногда к че ...

Атомистическая концепция строения материи
Атомистическая гипотеза строения материи выдвинута в античности Демокритом. В 18 веке доказана реальность существования атомов. Но вопрос о внутреннем строении атомов не возникал, т.к. они считались неделимыми. Исследования строения ато ...

Способы получения стволовых клеток
Основными способами получения стволовых клеток в клеточной медицине являются: • выделение и размножение собственных стволовых клеток человека (аутологичные стволовые клетки); • стволовые клетки пуповинной крови (плацентарной крови); • ...

Разделы