г. Определение положения интересующего нас сегмента во вставке
Для определения положения сегментов в небольших рекомбинантных геномах используются те же подходы, что и при нахождении специфических сегментов в больших геномах до клонирования. После построения рестрикционной карты вставки установить точную локализацию нужного сегмента не составляет труда. Для этого нужен только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК - или РНК-зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования.
Овальбумин-это белок, состоящий из одной полипептидной цепи; он синтезируется в яйцеводе курицы после стимуляции стероидным гормоном эстрогеном и накапливается в яичном белке. У кур-несушек стимуляция гормоном происходит в естественных условиях, а у цыплят образование яйцевода и синтез овальбумина индуцируются при введении эстрогена. Гормон индуцирует транскрипцию гена овальбумина, в результате чего содержание овальбуминовой мРНК в клетке увеличивается практически от нуля до 50000 молекул через две-три недели и падает до 10 молекул на клетку после прекращения воздействия эстрогена. Яйцеводы кур-несушек представляют собой хороший источник овальбуминовой мРНК, поскольку она составляет в них около 50% суммарной мРНК. Очищенную мРНК используют затем для приготовления радиоактивного зонда, применяемого для идентификации клонированного гена овальбумина. Зондом может служить радиоактивно меченная одноцепочечная кДНК, синтезированная непосредственно на мРНК с помощью обратной транскиптазы, или клонированная дуплексная кДНК. С помощью таких зондов из популяции Х-векторов, содержащих вставки геномной ДНК курицы, полученные при ограниченном гидролизе эндонуклеазой EcoRI, были отобраны клонированные последовательности овальбуминового гена. Вставка, имела длину 6,8 т.п. н. Из нее образовались три EcoRI-фрагмента, при этом только фрагмент длиной 2,35 т.п. н. отжигался с овальбуминовым кДНК-зондом.
Положение искомой последовательности в клонированном сегменте можно определить также с помощью электронной микроскопии. Для этого зонд и рекомбинантную ДНК смешивают, денатурируют и отжигают, а затем готовят препарат для микроскопирования. Комплементарные участки зонда и исследуемой молекулы образуют дуплексы, которые на электронных микрофотографиях выглядят как относительно толстые нити, а некомплементарные участки остаются одноцепочечными и имеют вид более тонких нитей. Гетеродуплекс, образующийся между овальбуминовым рекомбинантом формируются при условиях, благоприятных для гибридизации типа РНК'ДНК, а не ДНК'ДНК. В сегменте ДНК размером 2,35 т.п. н., который гибридизовался с мРНК, в образовании двухцепочечной структуры участвовали только около 550 п. н. Таким образом, гетеродуплексный анализ гораздо более информативен, чем определение положения кодирующих последовательностей в клоне. Он показывает, что, хотя мРНК содержит около 1800 п. н., в клонированном сегменте ДНК представлено менее трети длины кодирующих последовательностей гена овальбумина. Кроме того, 550 п. н. в клонированной ДНК, комплементарные мРНК, не образуют одну непрерывную последовательность, а распределены по четырем участкам, разделенным одноцепочечными петлями, т.е. кодирующие последовательности геномной ДНК чередуются с некодирующими. Как описано в разд.8.5, такие промежуточные последовательности, или интроны, типичны для эукариотических генов.
Прочие статьи:
Экономика ГМО. Состояние и перспективны
развития рынка генетически модифицированных товаров в мире
Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордоновской конференции (1973 г.) президиуму академии наук США ...
Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование
После отбора клонированных рекомбинантных молекул нужно охарактеризовать содержащуюся в них вставку. Для этого необходимо ответить на несколько вопросов. Прежде всего - действительно ли рекомбинантная молекула содержит нужный сегмент ДНК? ...
Человек
В результате хозяйственной деятельности человека — вырубки лесов, распашки целинных степей, осушение болот — численность многих видов бабочек значительно сократилась, а некоторые из них находятся на грани вымирания. Бабочки являются наибо ...