Макроструктура клонированной вставки
Страница 1

Для определения макроструктуры вставки сначала устанавливают ее размер и положение сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку клонированные фрагменты геномной ДНК часто бывают длиннее или короче, чем интересующая нас область, необходимо также определить положение и длину нужного сегмента внутри вставки.

а. Размер вставки

Размер векторной молекулы обычно бывает известен, поэтому размер вставки можно оценить, зная полную длину рекомбинантной молекулы и предположив, что никакого делетирования во время клонирования не произошло. Размер многих рекомбинантных молекул можно определить с помощью гель-электрофореза. Чтобы получить точные данные, кольцевые рекомбинантные молекулы превращают в линейные, поскольку электрофоретическая подвижность кольцевых структур зависит от степени их сверхспиральности. Стандартные электрофоретические методы непригодны для тестирования молекул, длина которых превышает 15 т.п. н, поскольку крупные молекулы мигрируют в геле слишком медленно. Поэтому размер многих рекомбинантных молекул не поддается прямому определению с помощью электрофореза, если только не используется импульсный электрофорез. Альтернативный способ оценки размера рекомбинантных молекул состоит в измерении их длины с помощью электронной микроскопии. Здесь тоже очень важны стандартные размеры, поскольку число пар оснований в сегменте определенной длины на электронной микрофотографии может зависеть от конфигурации молекулы и способа приготовления препарата.

Другой подход к определению размера вставки состоит в обращении тех реакций, которые использовались при конструировании рекомбинантных молекул, т.е. в вырезании вставок с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции. Размер линейной вставки определяют с помощью гель-электрофореза. Поскольку карта сайтов для эндонуклеаз рестрикции в векторной молекуле обычно бывает известна, идентифицировать встроенный фрагмент довольно легко. Если при лигировании произошла элиминация эндонуклеазных сайтов на концах вставки, можно использовать альтернативную процедуру: разрезать векторную молекулу по сайтам, находящимся в участках, которые фланкируют вставку; в этом случае вставка будет вырезана вместе с сегментами вектора известных размеров. Иногда ситуация осложняется тем, что сама вставка содержит сайты узнавания для используемой эндонуклеазы. В таком случае сумма размеров всех фрагментов, образующихся из вставки, даст ее общую длину. Если вставка слишком велика, то ее разрезание и суммирование могут оказаться даже необходимыми для более точного определения длины.

б. Картирование сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз

В тех случаях, когда вектор имеет небольшие размеры и не слишком сложен, положение сайтов иногда можно определить непосредственно в самой рекомбинантной молекуле. Однако часто оказывается необходимым сначала вырезать вставку и очистить ее от векторных сегментов.

в. Субклонирование

Длинные клонированные вставки, входящие в состав Х - или космидного вектора, часто бывают весьма неудобными для манипулирования. Поэтому после построения частичной рестрикционной карты вставку можно разделить на более мелкие фрагменты путем субклонирования. В принципе субклонирование не отличается от других методов создания рекомбинантных ДНК, просто в этих случаях в качестве исходного генома используют рекомбинантный клон. Для субклонирования обычно применяют рестриктирующие эндонуклеазы, сайты узнавания которых состоят из четырех пар оснований, поскольку они способны разрезать ДНК во многих местах.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Выращивание растений при искусственном освещении. Условия наилучшего использования электрического света.
Исследования показали, что на развитие растений в значительной мере влияет интенсивность и спектральный состав света. В связи с этим большой интерес представляют опыты В.И. Разумова, который доказал, что красный свет действует как естеств ...

Логика и закономерности развития науки. Современная научная картина мира. Дифференциация, интеграция и математизация в современной науке
Дифференциация - создание новых научных отраслей в результате расчленения традиционных наук на новые (например, из некогда единой науки о живых организмах выделились экология, цитология, физиология, генетика). В свою очередь новая наука ...

Биохимическая селекция, основанная на экзогенных генах
Этот подход избавляет нас от необходимости выделять специфический мутант, поскольку он подразумевает использование бактериальных генов, которые дают селективные преимущества при их экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого конструирую ...

Разделы