Для определения макроструктуры вставки сначала устанавливают ее размер и положение сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку клонированные фрагменты геномной ДНК часто бывают длиннее или короче, чем интересующая нас область, необходимо также определить положение и длину нужного сегмента внутри вставки.
а. Размер вставки
Размер векторной молекулы обычно бывает известен, поэтому размер вставки можно оценить, зная полную длину рекомбинантной молекулы и предположив, что никакого делетирования во время клонирования не произошло. Размер многих рекомбинантных молекул можно определить с помощью гель-электрофореза. Чтобы получить точные данные, кольцевые рекомбинантные молекулы превращают в линейные, поскольку электрофоретическая подвижность кольцевых структур зависит от степени их сверхспиральности. Стандартные электрофоретические методы непригодны для тестирования молекул, длина которых превышает 15 т.п. н, поскольку крупные молекулы мигрируют в геле слишком медленно. Поэтому размер многих рекомбинантных молекул не поддается прямому определению с помощью электрофореза, если только не используется импульсный электрофорез. Альтернативный способ оценки размера рекомбинантных молекул состоит в измерении их длины с помощью электронной микроскопии. Здесь тоже очень важны стандартные размеры, поскольку число пар оснований в сегменте определенной длины на электронной микрофотографии может зависеть от конфигурации молекулы и способа приготовления препарата.
Другой подход к определению размера вставки состоит в обращении тех реакций, которые использовались при конструировании рекомбинантных молекул, т.е. в вырезании вставок с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции. Размер линейной вставки определяют с помощью гель-электрофореза. Поскольку карта сайтов для эндонуклеаз рестрикции в векторной молекуле обычно бывает известна, идентифицировать встроенный фрагмент довольно легко. Если при лигировании произошла элиминация эндонуклеазных сайтов на концах вставки, можно использовать альтернативную процедуру: разрезать векторную молекулу по сайтам, находящимся в участках, которые фланкируют вставку; в этом случае вставка будет вырезана вместе с сегментами вектора известных размеров. Иногда ситуация осложняется тем, что сама вставка содержит сайты узнавания для используемой эндонуклеазы. В таком случае сумма размеров всех фрагментов, образующихся из вставки, даст ее общую длину. Если вставка слишком велика, то ее разрезание и суммирование могут оказаться даже необходимыми для более точного определения длины.
б. Картирование сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз
В тех случаях, когда вектор имеет небольшие размеры и не слишком сложен, положение сайтов иногда можно определить непосредственно в самой рекомбинантной молекуле. Однако часто оказывается необходимым сначала вырезать вставку и очистить ее от векторных сегментов.
в. Субклонирование
Длинные клонированные вставки, входящие в состав Х - или космидного вектора, часто бывают весьма неудобными для манипулирования. Поэтому после построения частичной рестрикционной карты вставку можно разделить на более мелкие фрагменты путем субклонирования. В принципе субклонирование не отличается от других методов создания рекомбинантных ДНК, просто в этих случаях в качестве исходного генома используют рекомбинантный клон. Для субклонирования обычно применяют рестриктирующие эндонуклеазы, сайты узнавания которых состоят из четырех пар оснований, поскольку они способны разрезать ДНК во многих местах.
Прочие статьи:
Принцип энтропии в термодинамики
Нельзя закончить этот краткий очерк истории развития классической физики, не сказав несколько слов о науке, которая целиком была создана учеными XIX в., о термодинамике.
В XVIII в. теплота представлялась в виде некоторой жидкости, общее ...
Возникновение условий для жизни
Примерно те же процессы, хотя и в значительно меньших масштабах, происходили и на Земле. Земное ядро стремительно сжималось. Из-за ядерных реакций и распада радиоактивных элементов в недрах Земли выделялось так много тепла, что образующие ...
Царство растений. Папоротники
Папоротниковидные –
одна из наиболее древних групп высших растений. Стебель короткий, находится в почке и представляет из себя корневище. В стебле хорошо развита проводящая ткань, между пучками которой располагаются клетки основной – пар ...