Чтобы до конца выяснить структуру, функцию и происхождение клонированного сегмента ДНК, необходимо установить его первичную структуру - нуклеотидную последовательность. Быстрые и точные методы определения последовательностей ДНК были созданы вскоре после разработки методов, используемых в работе с рекомбинантными молекулами. В принципе сейчас можно провести секвенирование молекулы ДНК любой длины. Определение последовательности сегментов ДНК протяженностью в сотни и даже тысячи нуклеотидов представляет собой рутинную процедуру, а примерно до 1975 г. это была очень трудная задача. Для этого с помощью РНК-полимеразы сначала получали РНК-копии ДНК, а затем определяли нуклеотидную последовательность кРНК. Точность и полнота процесса копирования часто были недостаточны, а секвенирование РНК занимало много времени. Сейчас секвенируют саму ДНК, а для секвенирова-ния РНК обычно вначале получают кДНК-копии.
а. Общие принципы
Методы секвенирования ДНК можно разбить на две категории. В основе одних лежат химические реакции, в которых используются непосредственно фрагменты очищенной ДНК. Во втором случае используют ДНК-копии очищенных сегментов, полученные ферментативным путем. Эти подходы имеют и некоторое сходство. Прежде всего фрагменты ДНК обычно очищают, что легко осуществить с помощью клонирования. Далее, и в том, и в другом случае за один раз секвенируется только одна цепь ДНК. Для повышения точности лучше провести секвенирование каждой цепи дуплексной молекулы и сравнить результаты. За один раз используют только одну из цепей, помеченную радиоактивным изотопом. Определяют нуклеотидную последовательность только этой цепи, и именно о ней мы будем говорить в последующих разделах. Третья общая особенность указанных методов состоит в том, что в обоих случаях образуется набор радиоактивно меченных одиночных цепей всех возможных длин - от единицы до п, где п - полная длина секвенируемой молекулы.
В обоих подходах, химическом и ферментативном, полный набор фрагментов на самом деле бывает представлен в виде четырех отдельных наборов. В идеале каждый такой набор содержит все возможные фрагменты, берущие начало на одном конце цепи и продолжающиеся до очередного местоположения определенного нуклеотида. Так, один из наборов содержит все возможные цепи, начинающиеся в одном сайте и оканчивающиеся в тех местах, где встречается дезоксиаденозин. Второй набор содержит все возможные цепи, начинающиеся в том же сайте, а заканчивающиеся на всех встречающихся поочередно дезоксицитидиновых остатках. Третий и четвертый наборы представлены фрагментами, оканчивающимися на остатках тимидина или дезоксигуанозина.
Химический и ферментативный методы отличаются друг от друга способом получения четырех наборов фрагментов. В первом случае этот набор получают путем разрезания предварительно радиоактивно меченной цепи четырьмя разными способами, а во втором четыре радиоактивно меченных набора фрагментов получают путем копирования немеченой цепи ДНК. Последним этапом в обоих методах является разделение фрагментов, составляющих каждый из наборов, по длинам с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. При этом удается разделить полинуклеотидные цепи, отличающиеся друг от друга только одним нуклеотидным остатком. Поскольку фрагменты несут радиоактивную метку, их легко выявить с помощью радиоавтографии, при этом достаточно лишь небольшого количества ДНК - порядка пикомолей или даже меньше. Все четыре набора, полученные из одного фрагмента
ДНК, подвергают одновременному электрофорезу на параллельных дорожках одной пластины геля. Сканируя каждую дорожку, расшифровывают всю последовательность. Используя специальные электрофоретические методы, можно разделить цепи размером от 1 до 300 или более нуклеотидных остатков. Молекулы, длина которых превышает несколько сотен нуклеотидов, фрагментируют и затем определяют нуклеотидную последовательность каждого фрагмента.
Прочие статьи:
Водная среда обитания – гидросфера
Вода покрывает 71% площади земного шара и составляет1/800 часть объема суши или 1370 м3. Основная масса воды сосредоточена в морях и океанах – 94-98%, в полярных льдах содержится около 1,2% воды и совсем малая доля – менее 0,5%, в пресн ...
Белки, препятствующие льдообразованию
Одной из функций белков, синтезирующихся в растениях при гипотермии, в частности, при действии отрицательных температур, является препятствование процессу льдообразования. Хотя, как было отмечено выше, в основном снижение температуры нача ...
Подготовка питательной среды
Когда готовят уксус из продуктов пищевой промышленности (вина, сыворотки, сусла, сидра), то необходимости в питательных добавках нет. Но если в качестве сырья используют технический спирт, картофельный или зерновой крахмал, то приходится ...