в. Ферментативное секвенирование
Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Для секвенирования ДНК с помощью ферментативного копирования необходимо иметь одноцепочечную ДНК, а также короткий полидезокси-нуклеотидный праймер, комплементарный небольшому участку ДНК. Одиночная цепь служит матрицей, а новая цепь наращивается, начиная с 3'-гидроксильной группы праймера путем присоединения дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. При секвенировании проводят четыре типа реакций копирования, в результате чего образуются четыре набора цепей, синтез которых остановлен на остатках А, С, G или Т. Остановка синтеза происходит в результате присоединения дидезоксинуклеотида, у которого отсутствует 3'-гидроксильная группа, что препятствует дальнейшему удлинению цепи. Реакции проводят таким образом, чтобы вероятность остановки синтеза на любом другом остатке, кроме заданного, была очень мала.
ДНК-полимераза I может утилизировать 2',3'-дидезоксинуклео-зидтрифосфатные аналоги нормальных дезоксинуклеозидтрифосфатных субстратов. Как и при обычной полимеризации, соответствующий дидезоксинуклеотид присоединяется к 3'-гидроксильному концу праймерной цепи, однако образующийся при этом продукт не может служить праймером для дальнейшего роста цепи, и реакция останавливается.
Для проведения четырех разных реакций копирования комплекс "матрица-праймер" инкубируют в присутствии всех четырех обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и какого-то определенного дидезоксинуклеозидтрифосфата. Например, в одной реакции используют ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, в другой - dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP и т.д. Удлинение цепи с помощью матричного копирования происходит до тех пор, пока вместо очередного дезоксинуклеотида не присоединится дидезоксинуклеотид; в этот момент рост цепи прекращается. Поскольку терминация синтеза происходит в случайных сайтах, образуется набор цепей всех возможных длин, начиная с 5'-конца праймера до сайтов, соответствующих положению присоединенного дидезоксинуклеотида. Новосинтезированные цепи являются радиоактивно меченными, поскольку в реакции используется по меньшей мере один радиоактивно меченный дезоксинуклеозидтрифосфат. Часто им является а-32-Р-дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть также 358--дезоксинуклеозидтрифосфат. Иногда используется радиоактивно меченный праймер. Продукты четырех реакций подвергают одновременному электрофорезу на отдельных дорожках, как при химическом секвенировании. Последовательность считывают с радиоавтографа, который выглядит так же, как и радиоавтограф, полученный при использовании химического метода секвенирования.
Получение одноцепочечной ДНК для секвенирования с помощью дидезокситерминаторов. Молекулы ДНК обычно являются двухцепочечными; исключение составляют лишь одноцепочечные ДНК некоторых бактериофагов. Как мы уже говорили, физическое разделение цепей дуплекса не всегда осуществимо. Для разделения цепей дуплекс денатурируют нагреванием или обработкой щелочью и проводят гель-электрофорез или хроматографию. Разделение двух комплементарных цепей происходит, по-видимому, благодаря различиям их конформаций, обусловленным различиями во вторичной структуре. Если разделения не произошло, применяют другие методы получения одиночных цепей. Наиболее эффективный из них состоит в клонировании фрагмента ДНК в векторе, сконструированном на основе бактериофага М13. Любая клонируемая вставка всегда будет фланкирована одними и теми же последовательностями векторной ДНК, что позволяет использовать стандартные праймеры. Их синтезируют химическими методами, и всегда можно выбрать удобный праймер. Кроме того, не составляет труда получить отдельные клоны, каждый из которых содержит одну из двух комплементарных цепей ДНК, благодаря чему легко осуществить секвенирование обеих цепей.
Прочие статьи:
Пубертатный скачок роста
Пубертатный скачок роста – это общее явление, варьирующее по интенсивности и продолжительности у разных детей. Максимальная скорость роста длины тела в среднем составляет около 10 см в год для мальчиков и немного меньше для девочек. У мал ...
Географическое распространение и экология обитания
В Черном море обитают 3 подвида азовского пузанка, отличающихся меньшим числом тычинок: С. с. palaeostomi (оз. Палеостоми на Западном Кавказе), С.с. nordmanni (северо-западная часть Черного моря и его реки, например, Дунай), С.с. tanaica ...
Связь поверхностного натяжения с адсорбцией
Рассмотрим соотношение между адсорбцией и поверхностным натяжением в рамках теории регулярных растворов. Для обсуждения адсорбции растворенного вещества на поверхности жидкость-воздух необходимо определить, что такое поверхность. Первое о ...