Тонкая структура клонированной вставки: нуклеотидная последовательность
Страница 3

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Тонкая структура клонированной вставки: нуклеотидная последовательность

в. Ферментативное секвенирование

Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Для секвенирования ДНК с помощью ферментативного копирования необходимо иметь одноцепочечную ДНК, а также короткий полидезокси-нуклеотидный праймер, комплементарный небольшому участку ДНК. Одиночная цепь служит матрицей, а новая цепь наращивается, начиная с 3'-гидроксильной группы праймера путем присоединения дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. При секвенировании проводят четыре типа реакций копирования, в результате чего образуются четыре набора цепей, синтез которых остановлен на остатках А, С, G или Т. Остановка синтеза происходит в результате присоединения дидезоксинуклеотида, у которого отсутствует 3'-гидроксильная группа, что препятствует дальнейшему удлинению цепи. Реакции проводят таким образом, чтобы вероятность остановки синтеза на любом другом остатке, кроме заданного, была очень мала.

ДНК-полимераза I может утилизировать 2',3'-дидезоксинуклео-зидтрифосфатные аналоги нормальных дезоксинуклеозидтрифосфатных субстратов. Как и при обычной полимеризации, соответствующий дидезоксинуклеотид присоединяется к 3'-гидроксильному концу праймерной цепи, однако образующийся при этом продукт не может служить праймером для дальнейшего роста цепи, и реакция останавливается.

Для проведения четырех разных реакций копирования комплекс "матрица-праймер" инкубируют в присутствии всех четырех обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и какого-то определенного дидезоксинуклеозидтрифосфата. Например, в одной реакции используют ddATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP, в другой - dATP, ddGTP, dGTP, dCTP, dTTP и т.д. Удлинение цепи с помощью матричного копирования происходит до тех пор, пока вместо очередного дезоксинуклеотида не присоединится дидезоксинуклеотид; в этот момент рост цепи прекращается. Поскольку терминация синтеза происходит в случайных сайтах, образуется набор цепей всех возможных длин, начиная с 5'-конца праймера до сайтов, соответствующих положению присоединенного дидезоксинуклеотида. Новосинтезированные цепи являются радиоактивно меченными, поскольку в реакции используется по меньшей мере один радиоактивно меченный дезоксинуклеозидтрифосфат. Часто им является а-32-Р-дезоксинуклеозидтрифосфат, но это может быть также 358--дезоксинуклеозидтрифосфат. Иногда используется радиоактивно меченный праймер. Продукты четырех реакций подвергают одновременному электрофорезу на отдельных дорожках, как при химическом секвенировании. Последовательность считывают с радиоавтографа, который выглядит так же, как и радиоавтограф, полученный при использовании химического метода секвенирования.

Получение одноцепочечной ДНК для секвенирования с помощью дидезокситерминаторов. Молекулы ДНК обычно являются двухцепочечными; исключение составляют лишь одноцепочечные ДНК некоторых бактериофагов. Как мы уже говорили, физическое разделение цепей дуплекса не всегда осуществимо. Для разделения цепей дуплекс денатурируют нагреванием или обработкой щелочью и проводят гель-электрофорез или хроматографию. Разделение двух комплементарных цепей происходит, по-видимому, благодаря различиям их конформаций, обусловленным различиями во вторичной структуре. Если разделения не произошло, применяют другие методы получения одиночных цепей. Наиболее эффективный из них состоит в клонировании фрагмента ДНК в векторе, сконструированном на основе бактериофага М13. Любая клонируемая вставка всегда будет фланкирована одними и теми же последовательностями векторной ДНК, что позволяет использовать стандартные праймеры. Их синтезируют химическими методами, и всегда можно выбрать удобный праймер. Кроме того, не составляет труда получить отдельные клоны, каждый из которых содержит одну из двух комплементарных цепей ДНК, благодаря чему легко осуществить секвенирование обеих цепей.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Значение наследия В.И. Вернадского
Следует отметить большую эвристическую значимость наследия Вернадского. В создании своего учения о ноосфере ученый исходил не только из точно установленных наукой законов и фактов. Он не смог бы поднять эту идею до высоты научной концепци ...

Обитатели трухлявых пней
Исследования в США, Великобритании и Франции, а начиная с 1946 года и в нашей стране, показали, что в природе хищные гри­бы отнюдь не редкость. Например, они всюду встречаются в почве, компосте и трухлявых пнях - словом, там, где происход ...

Мензбир Михаил Александрович
Мензбир Михаил Александрович (1855–1935) - родился 4 октября 1855 года в Туле, Российской империи, в небогатой дворянской семье. Его отец был военным; когда Михаил Александрович было 11 лет, он потерял мать, умершую от туберкулеза. Окончи ...

Разделы