б. Химическое секвенирование
Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Химическое секвенирование основано на специфической модификации различных пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляют затем из полимерной цепи с сохранением сахарофосфатного остова. Далее гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи, соседствующие с сайтом, где находилось удаленное модифицированное основание, в результате чего цепь разрывается. Все эти реакции, где в качестве примера рассмотрена модификация гуаниновых остатков. Представлены две реакции, одна из которых специфична в отношении только гуанина, а другая - только цитозина, и две реакции, специфичные в отношении либо пуринов, либо пиримидинов. Каждую из четырех реакций проводят с использованием отдельного препарата ДНК, в результате чего получают четыре набора фрагментов, необходимых для точного определения последовательности. Глубина каждой реакции строго ограничена, так что в каждой молекуле ДНК данного препарата в реакцию вступает в среднем только одно из чувствительных оснований. В результате популяция идентичных молекул ДНК превращается в ходе реакций, в которых участвуют случайные реакционно способные основания, в набор цепей, начинающихся в данном сайте на одном конце цепи и заканчивающихся на одном из реакционно способных оснований. Разрезание цепи происходит только по дезоксицитидиновым остаткам.
Каждая из четырех реакционных смесей на самом деле представлена двумя наборами цепей, получающихся в результате гидролиза препарата ДНК. Один включает все фрагменты, начинающиеся на 5'-конце исходной цепи, другой - все фрагменты, начинающиеся на 3'-конце. Нужную нам информацию о последовательности можно получить, используя любой из наборов, и выбор одного из них зависит от того, как был помечен исходный фрагмент - с 3' - или 5'-конца - перед проведением химических реакций, специфичных в отношении определенного основания. Немеченый материал нельзя визуализировать с помощью радиавтографии. Если исходным материалом является дуплексная ДНК, то помечена должна быть только одна из двух цепей, в противном случае конечные продукты будут представлены двумя разными наборами меченых цепей и данные будет трудно интерпретировать.
Введение метки в 5'-конец осуществляют с помощью полинуклеотидкиназы и у-32Р. Если присутствуют 5'-концевые фосфомоноэфирные группы, то их необходимо предварительно удалить с помощью фосфомоноэстеразы. Одноцепочечные молекулы секвенируют сразу после введения метки. Дуплексную ДНК после осуществления киназной реакции разделяют на две комплементарные цепи с помощью денатурации и электрофореза. Меченый двухцепочечный фрагмент можно также разрезать на две части по определенному внутреннему эндонуклеазному сайту и образовавшиеся фрагменты разделить с помощью электрофореза. В этом случае секвенируемые молекулы на самом деле являются двухцепочечными, но одна из цепей не содержит метки и поэтому остается "невидимой".
Введение метки в 3'-концы дуплексных цепей целесообразно проводить в том случае, когда на 5'-концах имеются выступы. Удлинение более коротких 3'-концов катализируется либо ДНК-полимеразой I, либо обратной транскриптазой, использующими выступающий 5'-конец как матрицу; 32Р включается в цепь в составе соответствующего а-32Р-меченного дезоксинуклеозидтрифосфата. Мечение по З'-концу происходит в каждой из цепей двухцепочечной ДНК, а для секвенирования необходимо иметь препарат, в котором все молекулы несут метку только на одном конце. Поэтому меченые двухцепочечные фрагменты расщепляют рестриктазой и фракционируют субфрагменты с помощью гель-электрофореза или разделяют цепи ДНК. Однако, если концы дуплексного фрагмента не идентичны, часто оказывается возможным прямое получение одноцепочечного 32Р-меченного конца. Например, если один из концов тупой, то его удлинения не происходит, и при соответствующем подборе а-32Р-меченного дезоксинуклеозидтрифосфата можно пометить только один из концов.
Прочие статьи:
Фтор как химический элемент
Фтор – элемент из семейства галогенов, в которое входят также хлор, бром, йод и искусственно полученный радиоактивный астат. Обозначается символом F (лат. Fluorum). Фтору свойственны все особенности собратьев по подгруппе, однако он подоб ...
Человек умелый (Homo habilis)
Homo habilis представлял собой двуногое существо ростом 120-140 см. Верхняя и нижняя челюсти были меньше, чем у австралопитека бойсеи (зинджа), но почти не отличались от челюстей питекантропа и современного человека. Кисть руки человека « ...
Запредельное торможение
Если безусловное и условное торможение играет координационную роль, т. е. выключает все рефлексы, мешающие осуществлению нервной деятельности, необходимой в данный момент, то роль запредельного торможения совсем иная. В известных пределах ...