Тонкая структура клонированной вставки: нуклеотидная последовательность
Страница 2

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Тонкая структура клонированной вставки: нуклеотидная последовательность

б. Химическое секвенирование

Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Химическое секвенирование основано на специфической модификации различных пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляют затем из полимерной цепи с сохранением сахарофосфатного остова. Далее гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи, соседствующие с сайтом, где находилось удаленное модифицированное основание, в результате чего цепь разрывается. Все эти реакции, где в качестве примера рассмотрена модификация гуаниновых остатков. Представлены две реакции, одна из которых специфична в отношении только гуанина, а другая - только цитозина, и две реакции, специфичные в отношении либо пуринов, либо пиримидинов. Каждую из четырех реакций проводят с использованием отдельного препарата ДНК, в результате чего получают четыре набора фрагментов, необходимых для точного определения последовательности. Глубина каждой реакции строго ограничена, так что в каждой молекуле ДНК данного препарата в реакцию вступает в среднем только одно из чувствительных оснований. В результате популяция идентичных молекул ДНК превращается в ходе реакций, в которых участвуют случайные реакционно способные основания, в набор цепей, начинающихся в данном сайте на одном конце цепи и заканчивающихся на одном из реакционно способных оснований. Разрезание цепи происходит только по дезоксицитидиновым остаткам.

Каждая из четырех реакционных смесей на самом деле представлена двумя наборами цепей, получающихся в результате гидролиза препарата ДНК. Один включает все фрагменты, начинающиеся на 5'-конце исходной цепи, другой - все фрагменты, начинающиеся на 3'-конце. Нужную нам информацию о последовательности можно получить, используя любой из наборов, и выбор одного из них зависит от того, как был помечен исходный фрагмент - с 3' - или 5'-конца - перед проведением химических реакций, специфичных в отношении определенного основания. Немеченый материал нельзя визуализировать с помощью радиавтографии. Если исходным материалом является дуплексная ДНК, то помечена должна быть только одна из двух цепей, в противном случае конечные продукты будут представлены двумя разными наборами меченых цепей и данные будет трудно интерпретировать.

Введение метки в 5'-конец осуществляют с помощью полинуклеотидкиназы и у-32Р. Если присутствуют 5'-концевые фосфомоноэфирные группы, то их необходимо предварительно удалить с помощью фосфомоноэстеразы. Одноцепочечные молекулы секвенируют сразу после введения метки. Дуплексную ДНК после осуществления киназной реакции разделяют на две комплементарные цепи с помощью денатурации и электрофореза. Меченый двухцепочечный фрагмент можно также разрезать на две части по определенному внутреннему эндонуклеазному сайту и образовавшиеся фрагменты разделить с помощью электрофореза. В этом случае секвенируемые молекулы на самом деле являются двухцепочечными, но одна из цепей не содержит метки и поэтому остается "невидимой".

Введение метки в 3'-концы дуплексных цепей целесообразно проводить в том случае, когда на 5'-концах имеются выступы. Удлинение более коротких 3'-концов катализируется либо ДНК-полимеразой I, либо обратной транскриптазой, использующими выступающий 5'-конец как матрицу; 32Р включается в цепь в составе соответствующего а-32Р-меченного дезоксинуклеозидтрифосфата. Мечение по З'-концу происходит в каждой из цепей двухцепочечной ДНК, а для секвенирования необходимо иметь препарат, в котором все молекулы несут метку только на одном конце. Поэтому меченые двухцепочечные фрагменты расщепляют рестриктазой и фракционируют субфрагменты с помощью гель-электрофореза или разделяют цепи ДНК. Однако, если концы дуплексного фрагмента не идентичны, часто оказывается возможным прямое получение одноцепочечного 32Р-меченного конца. Например, если один из концов тупой, то его удлинения не происходит, и при соответствующем подборе а-32Р-меченного дезоксинуклеозидтрифосфата можно пометить только один из концов.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Вклад в науку Ж.-Б. Ламарка (1744-1829)
- Ввел термины «биология» (1802), «зоология беспозвоночных» (1794) и определил их содержание. · Заложил основы систематики беспозвоночных. · Проводил обширные исследования в области ботаники, зоологии, систематики, палеонтологии, гидрог ...

Учёты и динамика численности енотовидной собаки
Учёты енотовидной собаки в Благовещенском районе проводят по убежищам, в весенне-летний период, когда выводки ещё не распадаются. Площадь обитания занимаемая одним выводком составляет ноль целых пять десятых квадратных километров. Исходя ...

Содержание генетической инженерии
В предыдущих разделах описывались генетические и эпигенетические механизмы наследственности. Современные методики позволяют модифицировать наследственную информацию и конструировать организмы с заданными наследственными свойствами. Эти ме ...

Разделы