Комбинируя клонирование в М13 и секвенирование с помощью дидезокситерминатора, мы можем получить эффективный способ определения последовательностей молекул ДНК, длина которых достигает нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для секвенирования длинных дуплексных молекул их разрезают механически на фрагменты и затем проводят клонирование. Каждая образующаяся бляшка содержит определенные фрагменты или цепи. Случайно отбирая клоны, определяют последовательность вставок. Поскольку вставки образуются в результате разрыва исходной молекулы ДНК в случайных местах, некоторые фрагменты содержат перекрывающиеся последовательности. С помощью компьютера сравнивают последовательность каждого фрагмента с последовательностями других фрагментов, выявляют перекрывающиеся области и располагают отдельные фрагменты в определенном порядке. Таким способом были определены последовательности митохондриальной ДНК человека и ДНК Х-фага.
Другое применение методов секвенирования. Секвенирование с помощью дидезокситерминаторов может применяться для прямого определения последовательностей РНК или ДНК, причем даже в том случае, если в смеси помимо секвенируемой цепи присутствуют неродственные молекулы. Важным элементом при этом является праймер, комплементарный небольшому интересующему нас участку и лишь с малой вероятностью ассоциирующий с другими молекулами, присутствующими в смеси. Подобной специфичностью обычно обладает праймер длиной 20 оснований с уникальной последовательностью. При таких условиях с помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК. Этот метод применим только в том случае, если мы уже достаточно много знаем об интересующих нас РНК или ДНК, но круг таких систем все время расширяется.
Метод химического секвенирования может применяться для анализа специфических последовательностей ДНК, присутствующих в смеси наряду с большим числом разных молекул ДНК, в том числе даже если речь идет об одном гене в суммарной геномной ДНК млекопитающих. Прежде всего ДНК разрезают с помощью рестриктирующей эндонуклеазы, так что интересующий нас сегмент оказывается во фрагменте длиной в несколько сотен пар оснований. Затем проводят химические реакции, специфичные к определенным основаниям, в результате чего образуются четыре набора фрагментов. Такие наборы включают все возможные по длине фрагменты с интересующей нас областью, начинающиеся в сайте рестрикции, по которому была разрезана ДНК. Здесь же присутствует множество других фрагментов из остальной части генома. Фрагменты разделяют путем электрофореза в секвенирующем геле, затем переносят на нейлоновый фильтр и отжигают с 32Р-меченным зондом, который комплементарен последовательности-мишени, находящейся вблизи одного из сайтов разрезания. Зонд ассоциирует со всеми фрагментами, образовавшимися начиная с одного конца последовательности-мишени, в результате чего на радиоавтограмме образуется типичная "секвенирующая лестница". Таким методом можно определить, например, нуклеотидную последовательность мутантных форм ранее клонированного гена. Он может использоваться также для определения характера метилирования специфической, уже клонированной области генома, поскольку гидразин реагирует с 5'-метилцитозиновыми остатками менее эффективно, чем с цитозиновыми и тиминовыми. О наличии 5'-метилцитозина в геле можно судить по отсутствию цитозинового остатка, представленного в соответствующем фрагменте ДНК, выделенном после клонирования и репликации в клетках Е. coli.
Прочие статьи:
«Золотое сечение» в природе
Профессор Университета Дьюка Адриан Бежан установил, что «золотое сечение» является не чем иным, как «дизайнерским упрощением» природы, которая нашла оптимальный способ унифицировать все живое и ускорить процесс зрительного восприятия объ ...
Обеспечение охраны труда. Работодатель обязан
- безопасность при эксплуатации производственных зданий, сооружений, оборудования, безопасность технологических процессов и применяемых в производстве сырья и материалов, а также эффективную эксплуатацию средств коллективной и индивидуаль ...
Понятие "норма", вариация и
аномалия по отношению к организму человека
Понятие "нормальный" до такой степени емкое, что впору счесть его совершенно бессмысленным.
Примером подмены понятия "среднее значение" понятием "норма" служит составленная Гезеллом "Таблица нормального ...