Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК
Страница 1

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК

В предыдущих разделах мы уже не раз останавливались на синтезе in vitro и in vivo полипептидов, кодируемых вставками в рекомбинантных векторах. Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии интересующего нас гена в клетках хозяина. Отбор нужных клонов такими методами, как HART и гибридизационная селекция, осуществляется с помощью трансляции in vitro, а функциональный анализ клонированного сегмента после введения его в исходную клетку основывается на изучении как транскрипции, так и трансляции. Цель многих экспериментов по клонированию состоит в синтезе нужного полипептида, а иногда - в получении его в количествах, достаточных для проведения фенотипического анализа. В ряде случаев цель клонирования состоит в получении антител. В этом разделе мы опишем некоторые системы хозяин-вектор, специально созданные для продукции нужного белка.

Синтез белков, предназначенных для проведения тех или иных исследований или для применения в медицине и промышленности, - это одна из самых первых задач, которые ставились при разработке технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время ряд поступающих в продажу ферментов, используемых для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, в свою очередь синтезируются под контролем генов, клонированных в плазмидных векторах E. coli. Использующиеся при этом препараты имеют высокую степень очистки, относительно недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-лигазу E. coli, обратную транскриптазу. Другие белки и их мутантные формы, полученные после сайт-специфического мутагенеза соответствующих клонированных генов, используют для установления связи между структурой белка и его функцией. К ним относятся алкогольдегидрогеназа, в-лактамаза, цитохром с - и тирозил-тРНК-синтетазы. С помощью методов клонирования были синтезированы важные в клиническом отношении белки, которые трудно было получить иным способом. Сюда относятся интерфероны, инсулин и гормон роста человека. Были синтезированы белки, кодируемые некоторыми вирусами животных и простейшими. Они использовались в качестве антигенов в некоторых вакцинах.

а. Выбор системы экспрессии

Для экспрессии уже клонированного гена выбор хозяина имеет такое же важное значение, как и при самом клонировании. Наиболее подходящими хозяевами для получения белка часто оказываются клетки E. coli, поскольку с ними просто манипулировать и их легко выращивать в больших объемах. После открытия интронов, прерывающих кодирующие участки многих эукариотических генов, для использования в экспрессирующих векторах

чаще стали применять клонированные кДНК, а не сами гены. Однако при синтезе активных форм определенных эукариотических белков в клетках E. coli возникает ряд проблем. Так, первичные продукты трансляции некоторых эукариотических генов должны подвергнуться специфическим посттрансляционным модификациям, прежде чем образуются функциональные молекулы. Обычно эти модификации состоят в протеолизе, фосфорилировании, ацетилировании и гликозилировании. Ферменты, катализирующие эти реакции в клетках Е. coli, обычно отсутствуют. Отчасти для решения этой проблемы были разработаны эффективные эукариотические системы экспрессии. В животных системах хозяин-вектор в качестве кодирующих последовательностей не обязательно использовать кДНК, поскольку эти клетки способны удалять интроны.

Векторы, предназначенные для эффективной транскрипции и трансляции клонированного сегмента, содержат элементы, повышающие эффективность репликации вектора и экспрессии соответствующих генов. Репликация как таковая для экспрессии генов не требуется, но, обеспечивая образование большого числа матриц для транскрипции, она повышает содержание мРНК и полипептидов в клетке. Таким образом, экспрессирующие векторы обычно содержат точку начала репликации и кодируют некоторые другие функции, необходимые для эффективной внутриклеточной репликации и не обеспечивающиеся хозяйскими клетками. Транскрипция зависит от наличия в векторе промотора, который соответствует присутствующей в клетках РНК-полимеразе, т.е. промотора E. coli для экспрессии в клетках бактерий и промотора, используемого РНК-полимеразой II, для экспрессии в эукариотических клетках. Этот промотор должен быть расположен в векторе таким образом, чтобы клонированный ген мог встроиться в правильной ориентации и за промотором по ходу транскрипции. Эукариотические экспрессирующие векторы должны также иметь сайт для расщепления и полиаденилирования транскрипта-предшественника функциональной мРНК. Для точной трансляции в начале кодирующей области должен находиться кодон ATG, а в конце - один из стоп-кодонов. Последний обычно содержится в клонированном сегменте, но стартовый кодон часто отсутствует во вставке кДНК, поэтому его функции должен выполнять вектор. Для трансляции в Е. coli на 5'-конце на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от инициирующего кодона должен находиться сайт связывания с рибосомой, последовательность Шайна-Дальгарно.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Антропный принцип
Итак, было приведено достаточно научных аргументов, свидетельствующих о том, что если исходить из очевидного факта наличия разумной жизни, то мы должны признать необходимость наложения вполне определенных ограничений на фундаментальные св ...

Этология сов. Взаимоотношение различных видов сов между собой
Во время наблюдений за отдельными парами сов, заселивших наши искусственные гнездовья, нами были отмечены также несколько случаев пересечения кормовых угодий различных пар сов одного или разных видов. Отчасти это было перекрывание с парам ...

Техника посадки зелёных черенков смородины
Черная смородина относится к культурам, зеленые черенки которых легко укореняются без каких-либо побочных на них воздействий. Однако многочисленными исследованиями было установлено, что обработка черенков регуляторами роста ускоряет и улу ...

Разделы