Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК
Страница 3

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК

Экспрессирующий вектор с trp-промотором. В векторе, перед полилинкером находятся trp-промотор, оператор, последовательность Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а также примерно 300 кодонов гена trp E. Транскрипцию можно контролировать, поместив содержащие плазмиду клетки Е. coli, выращенные до высокой плотности, в среду без триптофана и добавив затем 3-в-индолилакриловую кислоту. Последняя конкурирует с оставшимся триптофаном за связывание с trp-репрессором, однако образует неактивный комплекс, в результате чего происходит дерепрессия промотора. Как и в случае с вектором, содержащим Лас-промотор, при встраивании чужеродного гена в рамку считывания по одному из сайтов рестрикции в полилинкере синтезируется гибридный белок. Трансляция останавливается, дойдя до случайного стоп-кодона вектора.

В случае вставка кодирует обратную транскриптазу ретровируса. После трансфекции и дерепрессии в клетках E. coli синтезируется ферментативно активный гибридный белок. Для повышения стабильности обратной транскриптазы большую часть избыточных последовательностей гена trpE делетируют с помощью некоторых манипуляций и переклонирования. Несколько аминокислот trpE, остающихся на N-конце образовавшегося полипептида, слабо влияют на активность обратной транскриптазы.

Экспрессирующий вектор, использующий PL-npo-мотор бактериофага X. Вектор позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с чужеродным полипептидом. Транскрипция с этого промотора подавляется X-репрессором, который образуется профагом, присутствующим в клетке-хозяине. Применение клеток, лизогенизированных фагом, который кодирует чувствительный к нагреванию репрессор, позволяет индуцировать экспрессию гена путем переноса клеток, выращенных при 30°С, в среду с температурой 42°С. Кроме промотора вектор содержит часть последовательности Шайна-Дальгарно гена cII фага X. Между промотором и этой последовательностью находится группа регуляторных элементов фаговой ДНК, которые функционируют в цис-положении, ослабляя транскрипционную полярность. Эти последовательности с антиполярным эффектом функционируют при наличии продукта гена N фага X, поставляемого лизогенизированными хозяйскими клетками, которые обычно используются с вектором этого типа. В таком векторе сегмент, содержащий связывающийся с рибосомой участок Ш-Д-последовательности, включает также кодон ATG cII-гена фага X. Более того, ATG перекрывает BamHI-сайт, унаследованный от плазмиды pBR322. Эукариотические кодирующие участки встраивают в BamHI-сайт разными способами, зависящими от кодирующей последовательности. Очень важным моментом является встраивание кодирующей последовательности таким образом, чтобы она находилась в рамке с ATG. Таким образом, вектор поставляет все регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции, за исключением стоп-кодона, который обычно находится в пределах клонированных эукариотических кДНК.

в. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей

Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий рекомбинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP3 находится в цис-положении, а функциональные гены REP1 и REP2 - либо в цис-, либо в транс-положении. Применяются несколько разных регулируемых дрожжевых промоторов; в примере это промотор гена CYC1, кодирующего изо-1-цитохром с. Этот промотор и связанные с ним регуляторные сигналы составляют область размером в несколько сотен пар оснований, что типично для подобных сложных эукариотических областей, в которых транскрипция регулируется с помощью РНК-полимеразы II. Сегменты ДНК, трансляцию которых мы хотим осуществить, встраивают в рамку считывания в сайте. В этом случае они непосредственно прилегают к инициирующему кодону ATG гена CYC1. Сайт полиаденилирования в векторе отсутствует, но обычно кДНК содержат такой сайт, который расположен за стоп-кодоном трансляции.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Обновление фосфолипидов
Данные о скорости обновления липидов весьма скудны, известно лишь, что она весьма велика. В животных клетках половина всех фосфолипидов обновляется на протяжении одного или двух клеточных делений. Скорость обновления полярной и неполярной ...

Род псевдомонас (Pseudomonas)
Бактерии рода Pseudomonas широко распространены в природе. Их можно встретить в воздухе, почве, морских и пресных водоемах, сточных водах и иле, нефти и на газовых месторождениях. Псевдомонады были обнаружены на пищевых продуктах, телах ж ...

Гипотеза Уокера
Уокер обосновывал в 70-ых годах XX века родство археоптерикса и всех птиц с триасовыми архозаврами из подотряда сфенозухий, родственных современным крокодилам. Аргументы Уокера неоднократно критиковались, и сам автор впоследствии признал ...

Разделы