Экспрессирующий вектор с trp-промотором. В векторе, перед полилинкером находятся trp-промотор, оператор, последовательность Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а также примерно 300 кодонов гена trp E. Транскрипцию можно контролировать, поместив содержащие плазмиду клетки Е. coli, выращенные до высокой плотности, в среду без триптофана и добавив затем 3-в-индолилакриловую кислоту. Последняя конкурирует с оставшимся триптофаном за связывание с trp-репрессором, однако образует неактивный комплекс, в результате чего происходит дерепрессия промотора. Как и в случае с вектором, содержащим Лас-промотор, при встраивании чужеродного гена в рамку считывания по одному из сайтов рестрикции в полилинкере синтезируется гибридный белок. Трансляция останавливается, дойдя до случайного стоп-кодона вектора.
В случае вставка кодирует обратную транскриптазу ретровируса. После трансфекции и дерепрессии в клетках E. coli синтезируется ферментативно активный гибридный белок. Для повышения стабильности обратной транскриптазы большую часть избыточных последовательностей гена trpE делетируют с помощью некоторых манипуляций и переклонирования. Несколько аминокислот trpE, остающихся на N-конце образовавшегося полипептида, слабо влияют на активность обратной транскриптазы.
Экспрессирующий вектор, использующий PL-npo-мотор бактериофага X. Вектор позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с чужеродным полипептидом. Транскрипция с этого промотора подавляется X-репрессором, который образуется профагом, присутствующим в клетке-хозяине. Применение клеток, лизогенизированных фагом, который кодирует чувствительный к нагреванию репрессор, позволяет индуцировать экспрессию гена путем переноса клеток, выращенных при 30°С, в среду с температурой 42°С. Кроме промотора вектор содержит часть последовательности Шайна-Дальгарно гена cII фага X. Между промотором и этой последовательностью находится группа регуляторных элементов фаговой ДНК, которые функционируют в цис-положении, ослабляя транскрипционную полярность. Эти последовательности с антиполярным эффектом функционируют при наличии продукта гена N фага X, поставляемого лизогенизированными хозяйскими клетками, которые обычно используются с вектором этого типа. В таком векторе сегмент, содержащий связывающийся с рибосомой участок Ш-Д-последовательности, включает также кодон ATG cII-гена фага X. Более того, ATG перекрывает BamHI-сайт, унаследованный от плазмиды pBR322. Эукариотические кодирующие участки встраивают в BamHI-сайт разными способами, зависящими от кодирующей последовательности. Очень важным моментом является встраивание кодирующей последовательности таким образом, чтобы она находилась в рамке с ATG. Таким образом, вектор поставляет все регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции, за исключением стоп-кодона, который обычно находится в пределах клонированных эукариотических кДНК.
в. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей
Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий рекомбинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP3 находится в цис-положении, а функциональные гены REP1 и REP2 - либо в цис-, либо в транс-положении. Применяются несколько разных регулируемых дрожжевых промоторов; в примере это промотор гена CYC1, кодирующего изо-1-цитохром с. Этот промотор и связанные с ним регуляторные сигналы составляют область размером в несколько сотен пар оснований, что типично для подобных сложных эукариотических областей, в которых транскрипция регулируется с помощью РНК-полимеразы II. Сегменты ДНК, трансляцию которых мы хотим осуществить, встраивают в рамку считывания в сайте. В этом случае они непосредственно прилегают к инициирующему кодону ATG гена CYC1. Сайт полиаденилирования в векторе отсутствует, но обычно кДНК содержат такой сайт, который расположен за стоп-кодоном трансляции.
Прочие статьи:
Критические периоды в развитии зрительной системы
человека и их клиническое значение
Чувствительность котят и детенышей обезьян в ранние периоды жизни напоминает клинические наблюдения, выполненные на людях. Давно известно, что удаление непрозрачного хрусталика («катаракта») может привести к восстановлению зрения, даже ес ...
Грибы - паразиты человека и животных, их строение и размножение
Существует около 100000 видов грибов, разнообразных по внешнему виду и строению. Среди грибов есть микроскопически малые и гигантские организмы. Продолжительность жизни грибов – от нескольких дней до десятков лет.
Грибы распространены во ...
Влияние табака (никотина)
Курение является, можно сказать, вредной привычкой, принятой обществом. Часто бывает так, что курение является единственным поводом для общения, «уважительной причиной» для отдыха – перекура, когда коллеги выходят на лестницу или еще куда ...