Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК
Страница 2

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК

В экспрессирующие векторы часто бывают включены дополнительные элементы. Обычно они предназначаются для увеличения выхода полипептидов или для упрощения процедуры очистки нужного белка от других клеточных белков. Одним из основных факторов, ответственных за уменьшение выхода, является нестабильность многих белков в чужеродной клеточной среде.

Чтобы добиться экспрессии гена, обычно каждый раз приходится решать уникальную экспериментальную задачу. Поэтому многие экс-прессирующие векторы, хотя и обладают некоторыми общими свойствами, имеют свои особенности. Ниже мы рассмотрим системы, в которых используются оригинальные экспрессирующие векторы, предназначенные для конкретных целей.

б. Экспрессирующие векторы, используемые в E. coli

Векторы, сконструированные для осуществления эффективного белкового синтеза в E. coli, обычно происходят от pBR322 или другой высококопийной плазмиды; это необходимо для получения максимального числа матриц для транскрипции.

Промоторы. Большинство векторов, предназначенных для изучения экспрессии генов, содержат один из сильных промоторов, описанных в разд.3.11: Лас-промотор с соответствующим оператором, trp-промотор и оператор, а также Рь-промотор бактериофага X. Обычно используют мутантный промотор, называемый UV5, поскольку это позволяет осуществлять транскрипцию с большей скоростью, чем в случае промотора дикого типа, а кроме того, активность сохраняется даже в отсутствие положительного эффектора САР-сАМР. Другой часто используемый промотор, lac, представляет собой синтетическую конструкцию: его - 35-последовательность представляет собой - 35-последовательность trp-промотора, а блок Прибнова - соответствующую последовательность промотора UV5. Таким образом, 1ас-промотор идентичен оптимальному промотору E. coli, структура которого была определена исходя из данных, полученных при сравнении последовательностей многих природных промоторов. Как и ожидалось, он оказался весьма эффективным.

Помимо такого достоинства, как эффективность, эти четыре промотора обладают еще одним ценным свойством: они позволяют осуществлять временной контроль инициации транскрипции, поскольку связаны с регуляторными элементами. Это очень важно, так как накопление больших количеств чужеродного для E. coli белка может подавлять рост клеток и тем самым ограничивать конечный выход белка. Впрочем, если клетки удается вырастить до высокой плотности, а затем индуцировать к оптимальной экспрессии клонированного гена, то часто можно достигнуть оптимального выхода белка. Если белок, который предполагается синтезировать, нестабилен в клетках Е. coli, то молекулы, синтезированные в начале цикла роста, вероятно, деградируют ко времени достижения культурой высокой плотности. Поэтому имеет смысл отсрочить экспрессию до того момента, когда плотность культуры повысится достаточно сильно. Если используются векторы, в которых экспрессия клонированного гена зависит от этих промоторов, то количество нужного белка обычно составляет от 1 до 10% уровня суммарного белка в клеточном экстракте.

Экспрессирующий вектор с lac-промотором. Плазмидные векторы, содержащие промотор lac UV5, часто содержат также последовательность Шайна-Дальгарно ас-оперона и кодирующие последовательности для в-галактозидазы. Поскольку экспрессия, инициируемая на участке с ас-оператором-промотором, находится под контролем ас-оперона, транскрипцию можно инициировать с помощью индуктора изопропил-в-В-тиогалактозида. В приведенном примере вместо восьмого кодона в-галактозидазного гена встроен полилинкер, что нарушает кодирующую рамку. Клетки E. coli, несущие такой вектор, не способны синтезировать активную в-галактозидазу. Две части рамки считывания можно совместить, если в один из рестриктазных сайтов полилинкера встроить фрагмент с определенной рамкой считывания. В этом случае трансляция мРНК может инициироваться в начале кодирующего участка в-галактозидазного гена, проходить через вставку и остальную часть кодирующего участка этого гена и заканчиваться на обычном стоп-кодоне. В результате клетки, содержащие плазмиду с такой вставкой, будут продуцировать активную в-галактозидазу, поскольку первые восемь аминокислот молекулы несущественны для активности фермента и чужеродные аминокислоты не будут влиять на нее. Гибридный полипептид можно очистить, при этом показателем степени очистки будет служить удельная активность в-галактозидазы. В некоторых случаях гибридный белок можно расщепить и удалить протяженную карбоксильную в-галактозидазную часть. Однако и сами гибридные белки находят применение: с их помощью получают антитела к чужеродному белку.

Страницы: 1 2 3 4


Прочие статьи:

Морфологические признаки
У азовского пузанка есть несколько синонимичных названий: плоскун, плоскунец, пластун, пластунец. Пузанок отличается от азовской и черноморской сельдей относительно более высоким телом и головой, а так же укороченным хвостовым стеблем. В ...

Характеристика Астраханской области
Астраханская область расположена на юго-востоке Восточно-Европейской равнины, занимает Волго-Ахтубинскую пойму, дельту реки Волги и прилегающие к ним полупустыни Прикаспийской низменности, омывается Каспийским морем. Граничит на юго-запад ...

Будущее вселенной
Современная космология не может ответить на вопрос будет ли расширение продолжаться или сменится сжатием. Для этого нужно знать величину средней плотности вещества во Вселенной и его отношение с критической плотностью. Если средняя плотно ...

Разделы